产志贺毒素大肠杆菌基因分型技术的研究进展

Research Progress in Genotyping of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli

摘要: 产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是重要的食源性致病菌，能引起人和动物发生腹泻、出血性肠炎和溶血性尿毒综合症等疾病。为了更好的开展STEC检测、表征、分子进化分析及溯源调查，本文对国内外STEC基因分型技术包括基于酶切扩增分型方法、基于全基因组测序(Whole genome sequencing, WGS)分型方法以及多位点串联重复序列分析(MLVA)、DNA微阵列(DNA microarray)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)分型技术研究进展进行综述，并对基因分型研究方法存在的问题进行探讨，为STEC的溯源追踪和流行病学调查提供参考。

Abstract: Shiga Toxin-producing Escherichia coli (STEC) is an important food-borne pathogen, which can cause diseases, such as diarrhea, hemorrhagic enteritis and hemolytic uremic syndrome in humans and animals. In order to implement the detection, characterization, molecular evolution analysis and traceability investigation of STEC more efficiently, the worldwide STEC genotyping techniques including the genotyping methods based on enzyme-cut amplification and Whole Genome Sequencing (WGS), Multiple Locus Variable number of tandem repeat Analysis (MLVA), DNA microarray and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) were reviewed, and the issues of genotyping methods were discussed, which could provide the valuable information for the STEC traceability and epidemiological investigation.

1. 引言

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是一种能产生志贺毒素，并能引起人畜共患病的重要食源性致病菌，可以引起人体水样腹泻、出血性结肠炎等胃肠道疾病，严重时能导致溶血性尿毒综合症、血小板减少性紫癜等并发症甚至死亡 [1] [2]。人体感染STEC的途径非常多，主要包括两种：人体直接接触反刍动物的蓄水池直接感染，或者通过摄入受粪便污染的食物或水间接感染 [3]。自1982年首次发现STEC以来，已经发现400多种不同血清型的STEC，O157:H7是研究最多的血清型 [4]。除此之外，其它STEC血清型：O26:H2、O45:H2、O103:H11、O111:H8、O121:H19、O145:H28也能导致人体患病 [3] [4] [5]。由此可见，STEC血清型种类繁多，依靠传统检测分型手段难以快速识别感染源，导致人体感染STEC风险提高，因此掌握高效、高分辨率的STEC分型方法对保证食品安全尤为重要。

传统的表型分型技术通过菌体培养、结合生化检测和免疫反应等开展检测鉴定，其中应用较多的表型分型技术是免疫血清分型技术。该技术结合174种体细胞表面抗原(O-抗原)和53种鞭毛抗原(H-抗原)，用抗体检测抗原的方法 [6] [7]。目前，采用该方法已经鉴定出400多种不同血清型的STEC，并且根据报告的发病率和严重程度将其中几种血清型进一步分类为血清病理类型。命名范围从高发病率、致死的A类血清病理类型到症状轻微E类血清病理类型 [4]。尽管表型分型技术具有操作简单的特点，但是该技术却有很多局限性，如表型特征数量有限、成本高、劳动强度大、抗体可能发生逐批变异等缺点 [8]。目前研究报道最多的是基于DNA序列差异为基础的分型方法，这种方法不仅灵敏度、分辨率高、并且可将患者携带的STEC与污染源联系起来有利于开展流行病学调查，进而减少疫情的规模和地理范围。除此之外，基因分型技术分型能力更强，能区分传统表型分型方法不能分型的STEC血清型，如O182:H25型STEC采用传统血清凝集方法并不能鉴定、分型，而基因分型方法可基于DNA序列之间差异，通过与数据库序列比对，可快速、准确获得该型STEC血清型。因此，基因分型方法在STEC分型研究中越来越受到科研工作者亲睐。

本文根据分型方法不同，将基因分型方法归为以下几类：基于酶切扩增分型技术、基于高通量全基因组测序分型技术、多位点串联重复序列分析(Multiple locus variable number of tandem repeat Analysis, MLVA)分型技术、基于DNA微阵列(DNA microarray)分型技术、基于成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)分型技术，综述了STEC基因分型的研究进展，同时探讨了基因分型技术的优缺点，为STEC溯源追踪和流行病学调查选择基因分型技术方法提供理论依据。

2. 基于酶切扩增分型技术

2.1. PCR-限制性片段长度多态性

PCR-限制性片段长度多态性技术是传统RFLP (Restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术的演变。传统RFLP技术是利用限制性核酸内切酶酶切菌体染色体DNA形成特定DNA片段，然后利用电泳技术对限制性片段进行常规分型 [9]。而PCR-RFLP技术是先通过PCR扩增相应的目的片段(片段位于DNA保守区)，再对PCR产物进行酶切、电泳，最后通过观察比较限制性图谱分析序列之间的差异进行分型。

Shima等 [10] 利用PCR-RFLP方法对202株STEC O157片段V的多样性进行流行病学调查分析，结果显示202株菌可以分型为24组且这些菌株具有时间和空间上的相关多态性，并将分型结果与PFGE相比较，结果表明PCR-RFLP是一种更实用、更可靠的STEC分型方法。类似的研究也可见于Shridhar等 [11] 采用同样分型方法对192株非O157型STEC志贺毒素基因进行分型研究。除此之外，PCR-RFLP还应用与沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等分型研究 [12] [13] [14]。虽然PCR-RFLP技术应用广泛，但其实验操作复杂，实验周期长，已不能完全满足当今对食源性致病菌快速、准确分型的要求。

2.2. 扩增性片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)

1995年，Collegue和Vos首次提出了AFLP技术 [15]，原理是基于选择性基因组的一部分限制性片段实现分型，即用限制性核酸内切酶酶切菌体DNA，获得分子量不同的限制性片段，使用特定互补双链接头与限制性片段连接作为扩增的模板，接头序列含有核心序列和酶特异性序列，为PCR引物结合和限制性片段扩增的靶点，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物结合位点，3个选择性核酸加在接头3’端为粘性末端。

AFLP结合了RFLP和RAPD (随机扩增多态性DNA标记)技术特点，是一种非常快速和相对简单的实验室工作 [16]。Hahm BK等 [17] 采用AFLP、rep-PCR和PFGE对54株STEC分型，结果显示AFLP要比PFGE更快速、简便区分STEC分离株。除此之外，该方法另外一个优点是不需要提前了解菌株的序列信息，可以鉴别任何种类菌株，因此，AFLP技术应用非常广泛 [18] [19] [20]。然而，该方法在检测菌株方面存在局限性，如显性标记不易转化成位点特异标记，DNA纯度及内切酶质量要求高等。随着AFLP技术的发展和完善，目前，已经出现了一些新的AFLP技术如三限制性酶切AFLP (TE-AFLP)、二次消化AFLP (SD-AFLP)、单限制性酶切AFLP (SADF-AFLP)等 [21] 技术。张平平等 [22] 利用SADF-AFLP技术对113株O157:H7血清型STEC基因分型，通过此分型技术发现STEC在不同地区和不同物种之间存在相互传播。

2.3. 脉冲凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)

PFGE是将染色体DNA用限制性核酸内切酶消化，产生DNA大片段，通过改变外加正交变脉冲电场的方向、时间及电流大小，将大小不同的DNA分子分开，产生不同的电泳图谱，再利用BioNumerics软件生成直观的条带和聚类树状图，从而确定菌株间的亲缘关系。在流行病学调查、疾病爆发监测和菌群溯源等方面，PFGE被认为是最经典的方法。通过计算机处理PFGE数据，能够准确解释菌株亚型的数据信息 [23]，具有分辨率高的优点。美国PulseNet通过标准菌株的应用实现PFGE实验方法的标准化，被誉为细菌分子学分型技术的“金标准”。

王丽丽等 [24] 利用Swal、Smal和Apal三种内切酶酶切STEC基因组，采用PFGE方法将300株STEC分型，共获得161种表型，初步建立了我国STEC菌株的PulseNet数据库，且该数据库具有与其它国家数据库共享的潜力。类似的，Cotruta等 [25] 采用PFGE方法将15株STEC菌株O26血清型分成14种脉冲型，Mariana等 [26] 采用PFGE方法证明O157和非O157血清型分离株在同一批动物中间存在交叉污染。尽管PFGE分辨率高，有标准的实验操作流程，然而PFGE实验流程长，对暴发菌株不能快速、准确的分型。目前PFGE技术常与WGS技术联合应用于基因分型。

3. 基于高通量WGS分型技术

高通量测序技术近几年发展迅猛，它不仅能对单一物种进行深入的全基因组测序以及重测序，也可以对多种物种基因信息进行高效、准确的遗传差异分析，为微生物分型提供了更为有利的分析工具。在STEC分离株基因分型上，WGS技术应用主要体现在单核苷酸多态性分型(SNPs)、基于核心基因组多位点序列分型(cgMLST)。

3.1. 基于SNPs分型

SNPs分型主要根据菌株基因组特定位点碱基突变分型菌株，突变位点可以通过参考序列与组装的contigs比对来完成 [27]。SNPs分型方法选择的参考基因组序列必须与测序样本具有高度的亲缘性，否则在比对时会增加错配的机率。

Baha Abdalhamid等 [28] 对7株非O157血清型的STEC采用SNPs血清分型，结果显示7株菌株中6株菌株血清型为O26:H11，一株菌为O182:H25。除此之外，由于STEC菌株在分离过程中很容易受背景菌干扰，导致STEC很难从样品中分离鉴定。为了消除背景菌的干扰，Singh Novjot等 [29] 基于WGS技术创建RNA诱饵富集方法直接分析样品中的STEC，通过分析测序获得高质量SNPs，对样品中STEC直接血清型分析，这种方法无需获得STEC分离株，从而减少疫情溯源的成本和时间。同样的研究也见于Claire Jenkins等 [30] 通过分析两个暴发群STEC分离株SNPs，获得两个暴发群部分STEC分离株的共祖。因此，作为第三代分子标记技术，SNPs分型能力强、效率高、分辨率高，但是实验标准不统一，重复性差，且该技术需要一定的计算机操作技能。

3.2. 基于cgMLST分型

1998年，Maiden等 [31] 提出MLST方法，该方法是建立在MLEE (multilocus enzyme electrophoresis, MLEE)的基础上，根据ECMLST (https://www.shigatox.net/stec/cgi-bin/index)数据库提供的分型方案，一般测定6~10管家基因内部400~600 bp片段的DNA序列，根据每个位点发现时间的先后顺序赋予其一个等位基因编号，通过分析菌株的等位基因编号排列组成等位基因谱，该等位基因谱对应唯一的编号，即为此菌的序列型(sequence type, ST) [31]。该分型方法能够提供精确便携的数据，能较好地反应出进化和菌群生物学变异。在MLST的基础上扩展的cgMLST以WGS数据为基础，在构建核心基因组和分型的过程中，确保MLST管家基因存在于核心基因集合中，然后再将构建获得的最小生成树同已有的数据进行比对，保证分型结果的一致性。

Magdalena等 [32] 采用cgMLST对18株EHEC O80:H2血清型分型，结果显示18株EHEC均属于ST301，且cgMLST趋向于根据不同的毒力基因将菌株分为不同的簇，通过构建最小生成树追溯毒力基因的进化。类似研究也见于邵纯纯等 [33] 采用cgMLST对35株STEC分型，共获得14个序列型。其中O157:H7有8株，将这8株菌通过与数据库中进行比较，8株O157:H7产生了变异。

综上所述，cgMLST分型方法分辨率高，对菌株之间的细微变异扫描灵敏，为菌种鉴定及流行病学研究贡献了大量重要的数据基础。然而该方法操作较为复杂，且不同的实验方案获得不同结果影响实验室数据的比较、共享。

4. 其他基因分型方法

4.1. 基于MLVA分型

MLVA是选用多个数目可变串联重复序列(Variable number of tandem repeat, VNTR)位点分型的方法，具有简单、通量高、分辨率高等特点。通过对菌株测序，可获得大量高度保守的重复序列片段，利用重复序列片段的长度、拷贝数、位点不同等特征可进行菌株分型。MLVA分型方法要求采用的VNTR位点具备稳定性，否则分型结果容易出现误差。所采用的稳定位点由中间的核心区和外围的侧翼区组成，核心区含有两个或者两个以上头尾串联重复的短片段序列，每个片段长度6~40 bp不等，重复次数从几次到几百次不等 [34]。

Bai等 [35] 采用MLVA对30株来自中国不同地区O157血清型STEC分型研究，共获得23个表型，通过与PFGE及MLST分型结果比较，表明O157血清型STEC在食品加工过程中存在交叉污染。相似的研究也见于Chris等 [36] 采用MLVA、PFGE对84株临床非O157血清型STEC分型，结果表明MLVA在O26、O111、O103以及O121STEC具有更准确的分型。除此之外，MLVA技术也逐渐扩展到其它常见食源性致病菌的分型和流行病学溯源，如沙门氏菌、单增李斯特菌及金黄色葡萄球菌等 [37] [38]。MLVA技术在食源性致病菌的分型研究中应用广泛，但该技术仍有一些缺点限制了MLVA的应用，如需要高质量特异性引物、不同实验室获得的结果不能共享和比较，在国际上并没有统一的标准物质等。随着STEC全基因组序列的公布，越来越多的MLVA数据库在逐步建立和完善。为了便于不同实验室研究结果的比较和分析，需建立统一操作规程、试验标准等，进而构建全球或者地区统一MLVA数据库，使MLVA分型技术在STEC分型发挥更大作用。

4.2. 基于DNA微阵列分型

DNA微阵列又称DNA芯片技术，是一种程序化、规模化的基因分型技术，原理是先将基因片段有序的排列在处理过的载体上制成芯片，待测样品用荧光标记后与芯片杂交，最后通过荧光扫描及计算机的分析，获取样品核酸信息 [39] [40]。

目前，一些DNA microarray方法已经被用来鉴定分型STEC。Quinones B等 [41] 以stx1、stx2以及eae为靶点，设计低密度30-聚体寡核苷酸DNA microarray方法并结合光聚合比色方法对6株不同来源O157血清型STEC1株非STEC进行快速、准确基因分型。类似地，Quinones B等 [42] 设计的以O抗原基因簇为靶点，采用低密度30-聚体寡核苷酸DNA microarray方法对11株不同来源、血清型STEC也可以快速、准确基因分型。但是也有报道DNA microarray方法使用荧光分析会出现空间阻隔作用导致实验灵敏度降低 [43]。

DNA microarray能同时筛选多组特定基因标记，可用于在大量样本中对STEC进行快速准确的基因分型。除此之外，相比于WGS技术，DNA microarray不需要分析大量的序列，是一种值得推广的方法。

4.3. 基于CRISPR分型

CRISPR广泛分布在细菌和古细菌中，具有高度多样化的遗传结构。CRISPR由一段不连续的正向重复序列和插入其中的间隔序列组成。对于同一物种而言，大多数CRISPR位点的重复序列具有高度的保守性，而间区序列则具有高度多态性，因此基于间隔序列，CRISPR分型分析可用于病原菌的分型、鉴定及检测等 [44]，如已应用于结核分枝杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、空肠弯曲杆菌等菌株的分型和进化研究中 [45] [46] [47] [48]。

作为一种新兴的分型技术，采用CRISPR技术探究STEC的分型研究很少，Delannoy等 [49] 采用CRISPR技术对7种重要的STEC进行实时荧光PCR检测分析，结果显示毒力基因与O:H血清型存在特定的相关性。梁文娟等 [50] 采用CRISPR分型技术对705株STEC分型，结果显示CRISPR分型效果要比PFGE具有更高的分辨率。CRISPRs作为一种新颖基因分型研究方法，为STEC快速准确鉴定和预防提供新的思路。

5. 结语

由于STEC对公共卫生构成重大威胁，且存在大规模暴发的可能性，有必要采用效率高、分辨率高的分型方法进行有效监测。本文主要综述了STEC基因分型方法的研究进展，比较了基因分型方法与传统血清分型方法的异同点，分析了基因分型技术在STEC分型应用中的优点及局限性。鉴于STEC血清型复杂繁多，不同血清型菌株毒力、耐药等表型不同，需多种基因分型技术相结合开展回溯性分析，使STEC分型更加快速、准确。

基金项目

浙江省农业科学院省部共建农产品质量安全国家重点实验室(筹)开放基金课题(2010DS700124-KF2001)“鲜食蔬菜中致病性大肠杆菌基因组多态性与微进化研究”。

NOTES

^*通讯作者。