虫草菌净化水产养殖废水条件优化及效果

Purification Effect and Condition Optimization in Aquaculture Wastewater by Cordyceps sp.

摘要: 本研究尝试利用大型真菌虫草菌C058处理水产养殖废水。在无菌环境下，采用模拟废水考察了废水初始浓度、碳源添加浓度及接种量对C058去除污染物的影响，获得最适作用条件；进一步在开放环境下，分析了C058对模拟废水的处理效果；最后在开放环境下，探讨了C058对实际废水的处理效果。结果表明，C058的最适作用条件为原浓度废水、葡萄糖添加浓度550 mg/L，接种量1%，此时对NH₄⁺-N、TN和TP的去除率分别达到68.17%、56.41%和55.90%。在开放环境下，C058对模拟废水的处理效果略低于无菌环境条件(两者无显著性差异)，说明C058可以在开放环境中发挥净水作用。对三种代表性鱼塘水样，C058对NH₄⁺-N、TN和TP的去除率分别达到80.50%、67.80%和67.80%以上，同时C058菌丝生长量(以湿重计)增加了22.50%以上。可见，采用虫草菌净化水产养殖废水具有可行性，不仅去除了污染物，而且收获了有价值的虫草菌丝体，为水产养殖废水治理提供了新途径。

Abstract: This study tried to treat aquaculture wastewater with Cordyceps sp. C058. In a sterile environment, to obtain the best conditions, the effects of the initial concentration of wastewater, the addition con-centration of carbon source and the inoculation amount on the removal rate of pollution indicators were investigated by using the simulated wastewater. Further, the treatment effects of C058 on the simulated wastewater in an open environment were analyzed. The results showed that the optimal conditions for C058 were the original concentration of wastewater and the glucose added concen-tration of 550 mg/L, and the inoculation amount was 1%. At this time, the removal rates of NH₄⁺-N, TN and TP reached 68.17%, 56.41% and 55.90%, respectively. In an open environment, the treat-ment effect of C058 on simulated wastewater was slightly lower than that of the sterile environment (there was no significant difference between the two), indicating that C058 could play a role of puri-fying water in the open environment. For three representative fishponds samples, the removal rates of NH₄⁺-N, TN and TP by C058 were 80.50%, 67.80% and 67.80%, respectively, while the growth rate of C058 mycelium (measured by wet weight) increased by over 22.50%. It could be seen that using Cordyceps sp. C058 to purify aquaculture wastewater is feasible, not only to remove pollutants, but also to harvest valuable cordyceps mycelium, which will provide a new way for aquaculture wastewater treatment.

1. 引言

据统计，2018年中国水产养殖总产量为4905.99万t [1] [2] [3]。水产养殖业的迅猛发展为我国带来了巨大收益，但养殖技术水平较低，养殖过程缺乏严格管理，废水随意排放 [4]。水产养殖废水中含有大量的氨氮(NH+ 4-N)、总氮(TN)、总磷(TP)，主要来源于养殖动物代谢排泄物和饲料溶失，若排放到湖泊或河流中，会导致水体富营养化，影响人们的生活与健康 [5]。当前，水产养殖废水的净化技术主要以微生物技术为主 [6]，通过操纵微生物来净化水质，例如利用天然细菌和微藻的共生关系对水产养殖废水进行净化 [7] [8]。这些微生物主要以游离状态存在，分散于水体中，不易被回收利用，且回收成本高。相对于细菌和微藻而言，大型真菌在处理废水的同时，能够形成肉眼可见的菌丝球，更有利于回收利用 [9]。但尚未见有大型真菌净化水产养殖废水的报道。

已有研究表明，大型真菌可以广泛应用于不同类型废水处理，对很多污染物都有良好的处理效果，其作用原理包括生物吸附、降解、转化、还原 [10] - [17] 等。Hanafiah等采用塞尔维亚灵芝净化生活污水，对COD和NH+ 4-N的去除率分别达到96%和93.2% [18]；Przystas, W等利用平菇菌对印染废水进行脱色处理，目标物去除率达到90%以上 [19]；Kumar, V等以木霉菌处理电镀废水中的Cr (VI)，对Cr (VI)去除率达到99.4% [20]。可见，采用大型真菌净化水产养殖废水具有潜在可能性。然而，截止目前之所以未见大型真菌治理水产养殖废水的报道，可能原因是大型真菌为异养菌，其生长需要消耗一定量的碳源，而该废水中往往碳源不足 [21]，限制了该技术的研究应用。

虫草菌是一种典型的大型真菌，其含有丰富的多糖、蛋白质和氨基酸以及微量元素等营养物质 [22] [23] [24]，赋予虫草菌以增强免疫力、抑菌、抗炎、抗病毒、提高细胞活性及促进细胞增殖等功能 [25] [26]，可开发成水产动物和畜禽的高级饲料添加剂。本课题组在培养虫草菌时发现，其营养需求与模拟水产养殖废水组成十分一致 [27] [28]，唯一不能满足的就是碳源。因此，作者大胆设想，如果仅补充一些廉价的碳源，就能利用水产养殖废水培养虫草菌，既能够同化去除水产养殖废水中的氮磷等营养型污染物，又能收获具有显著经济价值的虫草菌丝体，那么该途径是具有理论和经济可行性的。据作者所知，目前国内和国外尚且未见任何有关虫草菌净化水产养殖废水的报道。本研究拟通过无菌环境下的作用条件优化、开放环境试验和实际废水处理等递进式试验，尝试证明采用虫草菌净化水产养殖废水的新途径。

2. 材料与方法

2.1. 供试材料

供试菌种：虫草菌C058 (图1a)，来自于广东省微生物研究所药用真菌研究组。

培养基：C8培养基 [27] 和水产养殖模拟废水 [28]，后者的葡萄糖碳源浓度为550 mg/L。

供试废水：取广州番禺的三个养殖池塘(北纬22˚56'7''，东经113˚29'52''，见图1(b)-(d))，所取水样(表1)置于4℃冰箱保存，三天内用完。

Table 1. Water quality parameters of the pond water samples

表1. 池塘水样水质主要参数

(a) 虫草菌C058，(b) 罗氏沼虾池塘Macrobrachium rosenbergii pond，(c) 南美白对虾池塘Penaeus vannamei pond，(d) 四大家鱼池塘The four major Chinese carps ponds

Figure 1. The strain of Cordyceps sp. and the aquaculture ponds

图1. 虫草菌和养殖池塘

2.2. 试验方法

2.2.1. C058的培养

从C058斜面取菌丝块接种至C8培养基中，在28℃、150 rpm培养至生长出大量新生菌丝球后，在2000 rpm条件下离心10 min收集菌丝球，以无菌水清洗3次，作为净水实验的接种物，备用。

2.2.2. 无菌环境下C058处理模拟废水的条件优化

取3种不同初始浓度(10倍浓度、原浓度和1倍稀释浓度)的模拟废水100 mL置于250 mL规格的锥形瓶中，盖上透气橡胶塞，在121℃灭菌20 min，待冷却后，于无菌操作台上接入1% (质量体积比)的C058接种物，在28℃、150 rpm的摇床上培养3 d后，将虫草菌丝滤出，烘干称量，根据虫草菌丝增重量间接反映对水产养殖废水中氮磷营养型污染物的同化去除效果；同时，测定经处理后废水中的NH+ 4-N和TN，确定模拟废水的初始浓度对C058净化效果的影响。

在最佳初始浓度下，改变其中的碳源添加浓度(葡萄糖添加量为0、137.5、275、550、1100、2200 mg/L)，其它同上，确定碳源添加浓度对污染指标去除率的影响。

在最佳初始浓度和碳源添加浓度下，改变接种量(0%, 0.25%, 0.50%, 1%, 2%, 4%)，其它同上，确定接种量对污染指标去除率的影响。综上，确定无菌环境下C058处理模拟废水的最佳作用条件。

2.2.3. 开放环境下C058对模拟废水的处理效果

在上述最佳作用条件下，取消无菌操作，即在培养基不灭菌、普通实验台接种、摇床上锥形瓶敞口(无橡胶塞)等条件下开放培养，其它同上，分析开放环境对C058处理模拟废水的影响。

2.2.4. 开放环境下C058对实际废水的处理效果

在上述最佳作用条件下，取表1中的三种实际废水100 mL至250 mL规格的锥形瓶中，开放培养，其它同上，探讨在开放环境下C058对实际废水的处理效果。

2.2.5. 分析测定与统计方法

NH+ 4-N的测定采用纳氏试剂比色法 [29]，TN的测定采用碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法 [30]，TP采用钼酸铵分光光度法 [31]。C058增长采用称重法。

每组实验设置3个平行样品，结果取平均值。

3. 结果分析与讨论

3.1. 无菌环境下C058处理模拟废水的条件优化

3.1.1. 不同初始浓度模拟废水对C058净化效果的影响

氨氮超标的话会危害鱼虾健康，严重时会导致鱼虾爆发性死亡，而总氮中的有机氮和硝态氮会向氨氮转化，因此我们重点关注了氨氮和总氮的去除。由图2可知，在模拟废水初始浓度不同的条件下，C058对模拟废水中NH+ 4-N和TN的去除率均较高，可达到54%~84%，说明虫草菌对不同浓度水产养殖废水都有良好的适应性。同时，模拟废水初始浓度与C058的生长的污染物去除率呈正相关，说明污染越严重，虫草菌净水效果越好。由于10倍浓度的模拟废水中NH+ 4-N、TN浓度过高，虫草菌丝块的净化NH+ 4-N、TN能力有限，即使去除率达到80%以上，但模拟废水中的NH+ 4-N、TN仍达到50 mg/L以上，水体中氮含量过高不仅会使鱼虾发生爆发性死亡，甚至有可能破坏谁与生态平衡。一般来讲，未处理的实际水产养殖废水的NH+ 4-N、TN浓度接近于原浓度和1倍稀释浓度的模拟废水 [32]。本研究中，经过C058的净化处理后，NH+ 4-N、TN浓度仅剩下13~16 mg/L，具有一定的去除效果，并且虫草菌丝增重量也间接证明了对水产养殖废水中氮磷营养型污染物的同化去除。综合考虑实际情况及试验效果，确定试验采用原浓度的模拟废水。

Figure 2. Effects of simulation wastewater initial concentration on C058 growth and the removal ratios of pollution indicators

图2. 不同初始浓度模拟废水中C058的污染物去除效果

3.1.2. 不同碳源添加浓度对C058净化效果的影响

Figure 3. Effect of added glucose concentration on the removal ratios of pollution indicators

图3. 不同葡萄糖添加浓度下C058的污染物去除效果

碳源是微生物组织细胞中重要的物质组成部分，碳源浓度的大小直接影响到微生物的生长及对污染物质去除的效率 [33]，尤其是真菌生长更离不开碳源 [34] [35] [36]。因此，在原浓度的水产养殖模拟废水条件下，考察碳源对C058去除水产养殖废水中NH+ 4-N、TN和TP的影响，结果如图3所示。随着葡萄糖添加量的升高，模拟废水中NH+ 4-N、TN和TP的去除率均呈现先缓慢上升后快速下降的变化趋势。在葡萄糖添加量处于0~275 mg/L范围时，随着葡萄糖添加量的升高，水体中NH+ 4-N、TN和TP的去除率分别从38.02%、31.02%和13.33%提高至44.62%、36.95%和36.36%。当葡萄糖添加量为550 mg/L时，C058对水体中NH+ 4-N、TN和TP的去除率达到最大，分别为68.17%，56.41%，55.90%。但是，当葡萄糖添加量继续升高时，NH+ 4-N、TN和TP的去除率却开始快速下降。这可能是因为碳源浓度过高时，水体中的碳氮比过大，使得水体中乙醇等次生代谢产物等物质积累过多 [9]，抑制了C058对模拟废水中的碳源、氮源及微量元素等营养元素的利用，无法达到净化水产养殖模废水中NH+ 4-N、TN、TP最佳效果，因此，在水模拟废水中葡萄糖最佳添加量为550 mg/L。

3.1.3. 接种量对污染指标去除率的影响

Figure 4. Effect of inoculation amount on the removal ratios of pollution indicators

图4. 接种量对污染指标去除率的影响

接种量的大小，直接影响着活菌数的数量和菌体的生物量，从而影响着污染指标的去除，但接种量过多，则会使得活菌数量和菌体生物量饱和，不仅导致成本增加，还有可能不利于微生物的生长，使得污染物质的去除效果变差 [37]。因此，在原浓度的模拟废水条件下，考察接种量对C058去除模拟废水中NH+ 4-N、TN和TP的影响，结果如图4所示。随着接种量的增大，模拟废水中NH+ 4-N、TN和TP的去除率均呈现先快速上升后缓慢下降的变化趋势。在接种量处于0.00%~0.50%范围时，随着接种量的增大，水体中NH+ 4-N、TN和TP的去除率分别从29.30%、23.50%和3.09%提高至47.87%、40.01%和24.72%。当接种量为1%时，C058对水体中NH+ 4-N、TN和TP的去除率达到最大，分别为68.17%，56.41%，55.90%。但是，当接种量继续增大时，NH+ 4-N、TN和TP的去除率却开始缓慢下降。这可能是因为当接种量过多时，水体中的营养物质满足不了C058的生长需求，无法达到净化模废水中NH+ 4-N、TN、TP最佳效果。结果表明，当接种量为1%时，C058净化模拟废水中NH+ 4-N、TN、TP的效果最好。

综上，C058的最适作用条件为原浓度废水、葡萄糖添加浓度550 mg/L，接种量1%，此时对NH+ 4-N、TN和TP的去除率分别达到68.17%、56.41%和55.90%，较之优化前分别提高了38.87%、32.91%和52.81%，说明对无菌环境下C058处理模拟废水的条件优化是有效的。值得指出的是，NH+ 4-N和TN的去除率均增加了35%左右，但TP的去除率增加了50%左右，这可得出在水产养殖水体中，相对于氮，C058对磷的去除效果更好。由于磷资源的不可再生性，全球越来越重视磷资源的可持续利用 [38]，若能通过虫草菌有效地回收磷资源，不仅节省废水处理成本，同时保证排水的低含磷量，解决水体富营养化的问题。

3.2. 开放环境下C058对模拟废水的处理效果

细菌污染是废水处理技术整体所面临的一个挑战，由于在实际应用中，难以避免细菌污染带来的影响，若发生细菌污染，则会形成拮抗作用，对底物进行竞争从而抑制虫草菌的生长 [39]。因此，在葡萄糖添加量为550 mg/L，接种量1%的条件下，考察开放环境下C058对模拟废水的处理效果，结果如图5所示。在开放条件下，C058对模拟废水中NH+ 4-N和TN的去除率分别达到78.86%和71.46%，并且C058的增重量达到0.1048 g左右。由于开放条件下培养C058，没有经过灭菌处理，故在培养C058的过程中可能因为其他微生物的存在，与虫草菌形成拮抗关系从而抑制了虫草菌利用模拟废水中营养元素，使得3d后开放环境下模拟废水中的NH+ 4-N、TN去除率略低于无菌环境下模拟废水中NH+ 4-N、TN的去除率，C058的增重量也略低于无菌条件下。但同时说明了开放环境下，细菌污染对C058的生长情况及污染指标的去除影响较低，这为C058应用于实际水产养殖废水提供理论依据。

Figure 5. Effects of non-aseptic condition and aseptic condition on C058 growth and the removal ratios of pollution indicators

图5. 开放条件及无菌条件对C058的增重量及污染指标去除率

3.3. 开放环境下C058对实际废水的处理效果

Figure 6. Treatment effect of three water samples from different aquaculture ponds by C058 and its growth

图6. C058对三个养殖池塘水样的处理效果及其生长量

由于细菌污染的问题，目前利用真菌去除水产养殖废水的研究主要停留在实验室阶段 [40]，但通过以上开放试验可知，细菌污染对C058去除水产养殖废水污染物的影响较低，所以进一步探讨能否利用实际废水培养虫草菌及虫草菌能否去除实际废水中的氮磷。为此，取了三种具有代表性的池塘水样，分别为罗氏沼虾池塘(池塘1)，南美白对虾池塘(池塘2)和四大家鱼混养池塘(池塘3)，进一步在葡萄糖添加量为550 mg/L，接种量1%的开放环境下，考察C058对三个养殖池塘水样的处理效果及其生长量，但虫草菌生长情况的探讨不同于前文，因为考虑到实际应用中可能是直接以收获的湿菌丝块投喂，故特意采用了湿重来表示菌丝块生长，结果如图6所示。C058对三个池塘水样中的NH+ 4-N、TN和TP的去除率均较高，可达到67%~88%左右，并且NH+ 4-N、TN和TP的浓度最低分别可降至0.17 mg/L，0.46 mg/L和0.01 mg/L，三个池塘中氮的浓度均可达到地表水环境质量标准中的II类水，磷的浓度更是可达到地表水环境质量标准中的I类水。对比其他微生物处理水产养殖废水的报道，如Siriphorn [41] 利用固定化螺旋藻处理南美白对虾养殖废水时，TN去除效率达到32.92%，武心华 [42] 利用芽孢杆菌处理刺参养殖用水时，NH+ 4-N去除效率达到65.5%，可见，虫草菌对水产养殖废水中氮磷的去除效果更理想，具有研究与应用潜力。另外，虽然C058的生长情况并没有达到预想的效果，但仍保持了生物量，说明在实际废水中虫草菌可以正常代谢利用氮磷营养性污染物。

4. 结论

1) 对原浓度的模拟废水，在葡萄糖添加量为550 mg/L，接种量为1%时，C058处理效果最佳，对NH+ 4-N、TN和TP的去除率分别达到68.17%、56.41%和55.90%。

2) 在开放环境下，C058以1%接种量接种至葡萄糖添加量为550 mg/L的模拟废水中培养3 d后，C058增重量达到0.1048 g及其对NH+ 4-N和TN的去除率分别达到78.86%和71.46%，为C058应用于实际水产养殖废水提供了理论依据。

3) 利用C058处理不同来源的实际水产养殖废水，都获得了良好效果。通过外加碳源方式，不同来源的实际水产养殖废水中NH+ 4-N、TN和TP的去除率分别达80%、67%和67%以上。

4) 此次试验只对水产养殖废水中NH+ 4-N、TN、TP等化学指标进行了跟踪，但其他生物指标(例如水体自然细菌群落、浮游植物和微型动物等)的影响及其相互作用关系有待进一步深入探究。

基金项目

广州市科技计划项目(201803030039，201704020187，B318221315)；仲恺农业工程学院优秀博士人才项目(Y002)资助。