摘要:
目的：利用计算机软件对已经公开的数据库进行挖掘和分析，确定口腔粘膜炎(Oral mucositis, OM)和伤口愈合相关的基因、蛋白、信号通路，对治疗OM可能有效的潜在药物进行预测和探索。方法：通过文本挖掘软件pubmed2ensembl确定与OM、伤口愈合相关的基因，去重后，用Venny 2.0筛选他们基因的交集，DAVID对交集基因进行基因功能的富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析。使用STRING对富集结果进行蛋白质–蛋白质相互作用的网络分析，Cycstcape进行蛋白质–蛋白质相互作用的模块分析。GEPIA进一步筛选模块分析的结果。最后，使用DGIdb进行分析，得到药物–基因相互作用的结果。结果：通过文本挖掘去重后，得到372个交集基因，对这些基因的生物学过程进行功能富集分析，并分析KEGG通路，通过蛋白质–蛋白质相互作用分析和模块分析，进一步筛选出37个相关基因。筛选出箱式图与生存率同时存在统计学差异的3个基因。最后，筛选出与之对应的38种药物。结论：使用文本挖掘、基因功能富集分析、分子途径等生物信息学工具，可以发现潜在的治疗OM的药物，为头颈部肿瘤放化疗后的放射性黏膜炎提供了新的线索。
Abstract:
Objective: Use computer software to mine and analyze the published databases to determine the genes, proteins and signal pathways related to Oral mucositis (OM) and wound healing, and to predict and explore potential drugs that may be effective in the treatment of OM. Method: Through the text mining software pubmed2ensembl, the genes related to OM and wound healing were identified. After de duplication, their gene intersections were screened with Venny 2.0. David enriched and analyzed the gene functions of the genes and the path analysis of Kyoto Encyclopedia of genes and genomes (KEGG). String was used to analyze the network of protein-protein interaction and cycstcap was used to analyze the module of protein-protein interaction. Gepia further screened the results of module analysis. Finally, dgidb was used to analyze the drug gene interaction. Result: After text mining and de duplication, 372 intersecting genes were obtained. The biological process of these genes was analyzed by function enrichment, and KEGG pathway was analyzed. Through protein interaction analysis and module analysis, 37 related genes were further screened. Three genes with statistically significant difference between box plot and survival rate were screened out. Finally, 38 corresponding drugs were screened out. Conclusion: Using bioinformatics tools, such as text mining, gene function enrichment analysis, molecular pathway and so on, we can find potential drugs for the treatment of OM.
1. 引言
放射性粘膜反应是头颈部肿瘤放化疗后主要不良反应之一，包括口腔黏膜炎、鼻腔黏膜炎以及咽喉炎等，口腔粘膜炎(Oral mucositis, OM)出现的频率最高 [1]。OM表现为在口腔粘膜表面形成片状薄层白色粘膜，红斑，弥漫性糜烂，脱皮，充血，出血等，不仅影响患者正常进食、吞咽、语言等，还可能导致脱水，酸中毒，甚至影响头颈部肿瘤的治疗或者延长其疗程。由于其成因复杂，目前，尚无特效药物可以治疗 [2]。生物信息学的工具，可以在众多研究的数据中，挖掘出相应的、有针对性的基因、蛋白或者信号通路，有可能提供新的药物研发。本研究利用生物信息学工具，筛选出可有效治疗OM的基因、分子途径以及蛋白质–蛋白质相互作用，进一步找到针对性的药物，提供治疗OM的新线索。
2. 资料与方法
2.1. 文本挖掘
使用pubmed2ensembl (http://pubmed2ensembl.ls.manchester.ac.uk/)进行文本挖掘，关键词为“Oral mucositis”和“wound healing”，检索出相关基因后，使用Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，取两者交集的基因集，保存此基因集，进行下一步数据分析。
2.2. 基因富集分析
DAVID是一个整合了多个生物学数据、分析工具的生物信息数据库，提供了大规模基因、蛋白系统综合的生物功能注释信息。应用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行基因富集分析，包括生物学过程(Biological process, BP)，细胞成分(Cellular Component, CC)，分子功能(Molecular Function, MF)以及KEGG信号通路(KEGG Pathway)分析。我们对保存的基因集进行了BP、CC、MF、KEGG Pathway分析。
2.3. 蛋白质–蛋白质相互作用网络的分析
将上一步基因富集分析得到的结果应用STRING (http://string-db.org)进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。STRING提供了一个基于PubMed文本挖掘数据、实验数据以及整合多个数据库资源的平台，可用来分析蛋白质之间的关系以及相互作用。选择“多种蛋白质”–种属“Homo”–检索–设置置信区间水平为最高(≥0.9)、隐藏单个的蛋白质。
下载Cytoscape (https://cytoscape.org/)，导入基因集，下载并运行MCODE、STRING模块，所有设置均为默认设置，即K-Core为2，Node Score Cutoff为0.2。Cytoscape是一个基于Java的开放源代码的网络可视化软件，可绘制基因表达调控网络、蛋白质–蛋白质作用网络等与网络、层级有关的数据。选择Nodes分别为37、33的蛋白质相互作用模块，构建可视化网络。选择与OM密切相关的Nodes为37的模块Shared Name，保存，并进行下一步分析。
2.4. 药物–基因相互作用分析
将上一步保存的基因集作为潜在靶点，打开GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)，在“expression DIY”中检索基因集中的每一个基因，“|Log2FC| Cutoff”为1，“P-value Cutoff”取0.01，数据集组织选择头颈部鳞状细胞癌“HNSC”，数据来源选择TCGA和GTEx数据库。在“Survival”里面选择“Survival Plots”，“Cutoff-High”、“Cutoff-Low”均选择50%，数据集组织选择头颈部鳞状细胞癌“HNSC”，绘制生存曲线图。
利用DGIdb工具(http://www.dgidb.org/search_interactions)进行药物–基因相互作用分析。DGIdb包含了NCBI Entrez、DrugBank、PharmGKB等临床试验数据库以及PubMed已经发表的文献数据等27个数据库的信息。选择表达量、生存曲线图均有统计学差异(P < 0.05)的基因，点击“Find Drug-Gene Interactions”，即可得到与此基因相互作用的药物。
3. 结果
3.1. 文本挖掘
通过文本挖掘，去掉重复基因后，与OM相关的基因为803个，与伤口愈合相关的为1409个基因，Venny2.0取交集后，筛选出372个与这两个关键词均相关的基因(图1)。
3.2. 基因功能富集及KEGG信号通路富集分析
通过DAVID的基因功能富集分析以及信号通路分析，按照统计学显著性P值大小从小到大的顺序排序，排在前五的BP、CC、MF以及KEGG Pathway显示：对有机物质刺激的反应很敏感，在细胞因子–细胞因子受体相互作用的调节中最丰富(图2)。
3.3. 蛋白质相互作用分析
利用STRING，将交集基因集进行蛋白质–蛋白质相互作用分析，得到蛋白质相互作用网络图。图3总共包含370个基因，有2个基因没有形成蛋白质–蛋白质相互作用网络。利用Cytoscape软件的MCODE进行模块分析，排名第一的是节点为37的蛋白质相互作用网络图。该分析结果表明主要与细胞因子–细胞因子受体相互作用的信号通路有关(图4)。
Figure 3. STRING protein interaction network diagram
图3. STRING蛋白质相互作用网络图
Figure 4. The most important modules in the protein interaction network
图4. 蛋白质相互作用网络中最重要的模块图
3.4. 基因–药物相互作用筛选
在GEPIA中，筛选出CSF2、MT2A、LAMC2共3个基因，箱式图、生存曲线均有统计学差异(P < 0.05)。即CSF2 (图5)、MT2A、LAMC2在头颈部肿瘤放化疗后OM中表达水平明显高于正常组织，生存率明显低于正常组织。
Figure 5. CSF2 box diagram (left), survival curve (right)
图5. CSF2箱式图(左)、生存曲线图(右)
利用DGIdb工具在线检索了针对CSF2、MT2A、LAMC2三个基因已经研发的或者正在研究中的药物48种。这48种包括经典的抗肿瘤药物、激素、抗病毒药物、免疫抑制剂等(表1)。
Table 1. Summary table of potential drugs for OM treatment against target genes
表1. 针对靶基因的治疗OM的潜在药物汇总表
4. 讨论
头颈癌是全球第六大常见的恶性肿瘤，每年约有600,000例新增病例 [3]。大多数为头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC)，晚期HNSC的治疗常常采用化疗、放疗等结合的方法治疗。放化疗后，有众多的不良反应，以OM最为常见。对于口腔粘膜炎的发病机制、药物等研究，已经足够深入，本研究则是在这些研究成果的基础上，进行文本数据挖掘，利用生物信息学软件、网站等工具，对有可能治疗OM的药物进行预测。尽管预测结果并不一定会成为临床用药依据，但，可作为一个探索方向，为以后的研究工作提供新思路。
本研究是基于高通量癌症基因组学数据，进行文本挖掘产生的研究假设，揭示OM与伤口愈合可能的关系 [4]。利用pubmed2ensembl对已经证实了的，与OM、伤口愈合相关的基因进行筛选，用Venny取两基因集的交集，共372个基因。
我们对第一步高通量文本挖掘得到的372个基因集进行基因富集分析，发现与对有机物质的应答、上调刺激产生的应答等生物学过程有关；与激活细胞因子、生长因子，与细胞因子受体以及生长因子受体结合等分子功能相关；与胞外区域、胞膜表面等有关。KEGG通路富集分析结果提示可能与细胞因子–细胞因子受体信号通路高度相关，同时与癌症的蛋白多糖、癌症的分子途径等有关。从而，我们认为，HNSC放化疗后的口腔粘膜炎发病机制复杂，涉及众多的基因、蛋白、信号通路。
我们希望通过STRING、Cytoscape分析蛋白质相互作用网络分析，进一步筛选出与OM作用最为紧密的基因，进一步揭露发病机制。经过GEPIA的再次筛选，最后，靶基因确定为CSF2、MT2A、LAMC2。CSF2为巨噬细胞集落刺激因子的一员，参与了多种癌症的发生发展，如黑色素瘤，结直肠癌等 [5]，在脑转移性甲状腺癌中CSF2是最重要的上调基因之一 [6] [7] [8]。CSF2还可诱导小胶质细胞瘤形成，刺激神经胶质细胞瘤的生长与侵袭 [5]。MT2A是金属硫蛋白的一类，与星形胶质细胞氧化应激有关，过表达的MT2A可促进多种肿瘤的发生 [8] [9]，可能与金属硫蛋白(MT)的促进细胞增殖、抗凋亡作用有关 [10]。在Martina Raudenska等人的研究中，证实MT2A与HNSC分级呈正相关，HNSC中MT2A的量远远高于瘤旁组织，DutschWicherek等人的研究结果表明当存在淋巴结转移时，瘤旁组织的MT2A浓度要高于瘤内组织 [11]。LAMC2即层粘连蛋白5γ-2，有研究表明：LAMC2在间变性甲状腺癌中高表达，与间变性甲状腺癌的增殖、细胞周期、迁移能力有关，通过激活细胞外调节蛋白激酶1和2增强癌细胞的侵袭能力 [12]。LAMC2的存在可能增加儿童神经母细胞瘤患病率 [13]，LAMC2可能参与口腔鳞状细胞癌的表观遗传学变化，抑制LAMC2的表达，可降低口腔鳞状细胞癌中肿瘤干细胞的侵袭、迁移能力。
基因–药物分析，针对靶基因的药物，为抑制剂和未知作用的药物，这些药物，大部分已经应用于临床多年，极少数还在试验阶段。大体上，安全性是有保障的，只是，部分药物未应用于治疗头颈部肿瘤放化疗后的OM。如果条件允许，可以先进行这部分的药物研发，尝试局部治疗，这个过程，可能需要探索多个基因、蛋白、信号通路 [14] [15]。
综上所述，本研究应用文本挖掘工具，通过对之前的研究进行探索，利用生物信息学工具，进行基因富集分析以及信号通路分析，建立蛋白质相互作用网络，并最终筛选出最密切的基因，找到潜在的可能有效治疗头颈部肿瘤放化疗后的口腔黏膜炎药物。最终，这些药物是否有效，则需要基础实验以及临床试验验证。