1. 引言
蝉花是蝉棒束孢寄生在蝉幼虫上形成的虫菌复合体，是我国传统名贵中药材之一。在我国云南、浙江、安徽、广东、四川和福建等省有长期食用蝉花虫草的习惯。早在公元五世纪的南北朝时期雷斅在其著作《雷公炮炙论》中便有关于蝉花加工方法的记载，隋唐时期甄权、宋代苏颂、明代李时珍均对其有所研究 [1]。《本草纲目》记载蝉花寒性、味甘、无毒，具有散风热、定惊镇痉、明目等功效。现代药理学研究表明蝉花具有免疫调节 [2] [3] [4] [5] [6]、抗应激 [7]、抗肿瘤 [8] [9] [10]、镇静催眠 [4] [11] 和调节脂类代谢 [2] [12] 等作用。
蝙蝠蛾拟青霉是从天然冬虫夏草中分离得到的与冬虫夏草具有相似化学成分的真菌，其液体发酵菌丝体含有多糖、虫草酸、核苷类物质等功效成分 [13] [14]，具有免疫调节 [15] [16] [17]、抗肿瘤 [18]、抗病毒 [19]、及抗疲劳 [20] [21] 等多种功效。
本文研究了由人工培养蝉花孢梗束和蝙蝠蛾拟青霉液体发酵菌丝体按照比例混合后，经基酒浸泡60天制成的复合虫草酒的免疫活性。本研究根据国家保健食品相关法规要求，在指定单位对蝉花孢梗束和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体复合虫草酒的免疫功能进行评价研究 [22]。
2. 材料和方法
2.1. 样品
浙江泛亚保健食品有限公司提供。按照每升添加13.3 g蝉花子实体干品和1.4 g蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；同样用26.6 g蝉花子实体干品和2.8 g蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；分别得到低剂量和高剂量成品酒。然后通过蒸馏浓缩和调配使低剂量和高剂量含药量分别为18.18 g/L和36.36 g/mL，酒精度为15%。
4 ℃
冷藏。按照人体推荐量为2.66 g/日·60 kg BW进行试验 [23]。
2.2. 实验动物
ICR小鼠60只，SPF级，初始体重18~22 g，雄性，合格证号：201808403，由南京医科大学提供。实验鼠粮，规格：20 kg/袋，江苏省协同医药生物工程有限公司提供。饲养环境：屏障实验室，温度18℃~24℃，相对湿度40%~70%。动物实验符合安徽省医学科学研究院实验动物伦理和福利要求。
2.3. 试剂与仪器
2.3.1. 主要试剂
绵羊红细胞(SRBC)，南京茂捷微生物科技有限公司，批号：20170904001；2%绵羊红细胞(SRBC)，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170911；1%鸡红细胞悬液，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170918；氧化性辅酶I，Amresco提供；Triton，天津市光复精细化工研究所等。
2.3.2. 主要仪器
XDS-1B显微镜，重庆光电仪器有限公司；HERA cell 150i CO2培养箱，美国Thermo Electron公司；NU-430-400E超净工作台，美国NUAIRE；DS-671电子秤，上海寺冈电子有限公司；AL104电子天平，梅特勒–托利多(上海)有限公司；鼠静脉注射固定架；JS-306电子秒表，深圳市君斯达实业有限公司；550型酶标仪，Biorad公司等。
2.4. 剂量选择、受试样品给药方式和时间
人用剂量为2.66 g/日，以人体60 kg计，即为0.045 g/kg。以人体推荐量的10倍设为低剂量组(0.45 g/kg)，以20倍设为高剂量组(0.9 g/kg)。灌胃容积均为0.25 mL/
10g
。蒸馏水作为空白对照组，灌胃给药，每组10只。各组小鼠经口灌胃给予相应的受试样品，每天1次，连续30天。
2.5. 实验方法
2.5.1. 免疫器官指数的测定
称重小鼠，断髓处死取胸腺、脾脏，用电子天平称重，计算脏器指数，即胸腺(或脾肺)质量占小鼠体质量的百分比 [24]。
2.5.2. 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
参照李志成等人的方法进行 [25]。
2.5.3. 血清溶血素的测定实验(血凝法)
参照黎奔和杨志明等人的方法进行操作 [26] [27]。
2.5.4. 小鼠碳廓清实验
参照黎奔等人的方法进行操作，以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算吞噬指数a [26]。
(公式1)
(公式2)
2.5.5. 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
参照金龙哲等人的实验方法进行操作，在40×显微镜下计数吞噬率和吞噬指数。每张片计数100个巨噬细胞，吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数 [28]。
(公式3)
(公式4)
2.6. 数据统计处理
实验数据用平均值 ± 标准差表示，采用SPSS19.0统计软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，使用Duncan新复极差法对不同组间数据进行差异显著性比较，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
3. 结果与讨论
3.1. 对免疫器官系数的影响
实验小鼠经口给予不同剂量的培养蝉花孢梗束和蝙蝠蛾拟青霉液体发酵菌丝体复合虫草酒30天。观察复合虫草酒对小鼠胸腺系数、脾脏系数的影响。结果如表1所示，不同剂量复合虫草酒小鼠的胸腺系数和脾脏系数与对照组的差异均无统计学意义(P > 0.05)。
Table 1. Effect of combined Cordyceps wine on coefficients of immune organs of mice ( X ¯ ± S , n = 10)
表1. 复合虫草酒对小鼠免疫脏器系数的影响(
, n = 10)
3.2. 复合虫草酒对小鼠体液免疫功能的影响
实验小鼠经口给予不同剂量复合虫草酒30天，通过小鼠抗体生成细胞实验和血清溶血素实验研究复合虫草酒的体液免疫活性，结果如表2所示。复合虫草酒低剂量组和高剂量组溶血空斑数与对照组相比无显著性差异(P > 0.05)，表明高低剂量复合虫草酒无促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。高剂量组复合虫草酒抗体积数较对照组提高了62.94%，显著高于对照组和低剂量组(P < 0.01)；低剂量组抗体积数较对照组提高了12.59%，但是差异无统计学意义(P > 0.05)。表明高剂量组复合虫草酒具有显著提高小鼠的抗体积数的作用，与宋捷民等人对蝉花免疫功能的研究结果一致 [4]。
3.3. 复合虫草酒对小鼠单核巨噬细胞免疫功能的影响
通过小鼠碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验研究了复合虫草酒对小鼠单核巨噬细胞功能的影响，结果见表3。复合虫草酒低剂量组和高剂量组小鼠碳廓清吞噬指数与对照组比较均无显著性差异(P > 0.05)。复合虫草酒低剂量组和高剂量组小鼠单核巨噬细胞鸡红细胞吞噬指数相较对照组分别提高了44%和40%，均与空白对照组有极显著差异(P < 0.01)，表明低剂量和高剂量复合虫草酒均可以提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。复合虫草酒低剂量组和高剂量组的吞噬百分率分别提高了21.57%和19.61%，均显著高于空白对照组(P < 0.01)。根据单核巨噬细胞功能测定结果中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定复合虫草酒的单核巨噬细胞功能测定结果阳性。表明复合虫草酒具有提高小鼠单核巨噬细胞吞噬活性，具有促进免疫功能的作用。
Table 2. Effect of combined Cordyceps wine on numbers of hemolytic plaques and antibodies of mice (X ± S, n = 10)
表2. 复合虫草酒对小鼠溶血空斑数和抗体积数的影响(X ± S, n = 10)
注：与阴性对照组比较，*P < 0.05，*P < 0.01，下同。
Table 3. Effects of combined Cordyceps wine on carbon clearance and peritoneal macrophages of chicken erythrocytes of mice (X ± S, n = 10)
表3. 复合虫草酒对小鼠碳廓清和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响(X ± S, n = 10)
4. 结论
现代免疫学认为，免疫力是机体自身的一种防御机制，是机体识别和消灭外来异物，识别和处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞和病毒感染细胞的能力。人体的免疫力受遗传基因和环境因素的影响，如饮食、睡眠、运动、压力等。其中，饮食对免疫力具有决定性的影响，有些食物或药物的成分能刺激免疫系统，增强机体免疫能力 [29]。
本实验以复合虫草酒0.45 g/kg∙BW/d (低剂量)和0.9 g/kg∙BW/d (高剂量)两个剂量经口给予小鼠1个月，进行小鼠免疫器官系数、体液免疫功能、单核巨噬细胞活性的测定。结果表明，复合虫草酒高剂量组能够显著提高小鼠抗体积数，较空白对照组提高了62.94%；高、低剂量组能明显提高小鼠的鸡红细胞吞噬指数，较对照组分别提高了44%和40%，吞噬百分率较空白对照组分别提高了21.57%和19.61%。综上可判断，高剂量组复合虫草酒具有一定增强小鼠体液免疫和单核巨噬细胞吞噬活性的作用。
基金项目
科技部星火计划项目(2015GA710033)；滁州学院科研项目(2017PY04)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201910377026)。
NOTES
*通讯作者。