1. 引言
表观遗传学研究表明，非编码调控RNA，也称为小RNA (sRNA)在调控细菌基因表达方面发挥多元化重要作用，因而也备受关注 [1] [2]。在革兰氏阴性细菌中已知有两种主要类型的调控sRNA。一种属于依赖Hfq的sRNAs，通过RNA分子伴侣Hfq介导靶基因mRNA的5’-非翻译区(5’-UTR)与某些sRNAs的碱基配对，干扰或促进靶基因mRNA与核糖体的结合，从而调控mRNA的翻译或稳定性。第二种是CsrB家族sRNAs，他们与RNA结合蛋白CsrA/RsmA，以及sRNA分解因子GGDEF/EAL域蛋白CsrD等一起组成Csr/Rsm转录后全局调控系统，位于细菌调控网络的中心，并整合其他调控因子协同控制细菌的碳代谢、分泌系统、毒力或生防因子、运动性以及生物膜形成、胁迫反应和细菌定植等生理活动和行为，从而影响其适应性。其中CsrA/RsmA，通常与核糖体的SD序列结合，导致靶基因mRNA的翻译受抑制。而CsrB/CsrC sRNAs及其同源物RsmB/RsmC等，包含多个CsrA/RsmA的结合位点A(N)GGA，作为CsrA/RsmA翻译阻遏蛋白的拮抗物发挥作用。可与多个CsrA/RsmA蛋白结合释放核糖体结合位点，解除其翻译抑制 [3] [4]。
生防因子普城沙雷氏菌S. plymuthica，可产生多种抗真菌因子，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等细胞壁降解酶，以及硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN)和植物生长素吲哚乙酸IAA等，在德国已经被开发并注册为生物农药。其中抗生素PRN具有广谱抗真菌、抗细菌和抗线虫活性，作为苯吡咯家族杀真菌剂(fludioxonil and fenpiclonil)的天然前导化合物在农业和制药领域具有广阔的应用前景。更重要的是，30多年来鲜有田间应用产生抗药性的报道 [5] [6]。PRN由操纵子prnABCD编码，核酸序列高度保守，仅由少数细菌Pseudomonas Burkholderia和Serratia等产生。我们前期已经克隆和鉴定了S. plymuthica内生菌株G3中的prn操纵子，并且阐明PRN生物合成在G3菌株中受到严格调控。例如转录水平的N-乙酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)介导的群体感应系统(quorum sensing, QS)和稳定期的Sigma因子RpoS [7] [8] [9] [10]，以及转录后调控子Hfq [11] 及其相互作用形成了调控PRN的网络。本研究在前期已构建获得G3菌株RsmB突变体ΔrsmB的基础上 [12]，通过组合突变分析和LC-MS液质联用定量分析等，首次证明细菌sRNA RsmB可通过与QS互作，分别在转录和翻译水平上参与全局调控G3菌株PRN的生物合成和生物膜形成等。为进一步通过遗传操纵Rsm系统改良生防菌的效率和稳定性提供了新策略。
2. 材料与方法
2.1. 细菌菌株及其生长条件
内生菌株S. plymuthica G3 (RifR)野生型是分离自小麦的内生菌，具有自然利福平抗性。野生型G3和前期研究中已经构建完成的RsmB突变体ΔrsmB(GmR)，和检测AHLs信号的报告菌株产紫色杆菌Chromobacterium violaceum CV026 (KmR) [8] [12] 等生长于LB或LBA培养基，置于28℃恒温培养。抗生素使用的终浓度如下：利福平 (Rif) 30 μg/ml；卡那霉素(Km) 50 μg/ml；庆大霉素(Gm) 25 μg/ml。
2.2. 试验方法
2.2.1. 抗生素PRN的提取与定性和定量分析
挑取野生菌G3及其RsmB突变体ΔrsmB的单菌落接种添加利福平或庆大霉素的LB，过夜培养16 h。OD600调至0.1，分别取等量菌液涂布于含2%甘油的PDA平板上，每个菌株设四个重复，28℃培养5天。经乙酸乙酯萃取2次合并上清有机相，旋转蒸发干燥后，用甲醇溶解。真空干燥后，重新溶解于20 μL甲醇，置于−20℃冰箱中避光密封保存待用。
TLC板37℃过夜预热，点样时以2 μL的标准样品(2 mg/mL)为对照，提取的样品各10 μL上样，展开剂为正己烷:乙酸乙酯 = 2:1，进行TLC层析。完成后使用2%对二甲氨基苯甲醛喷雾显色观察，待TLC板干燥后，拍照。同时，以上样品参照Liu et al., 2018的方法 [10]，采用LC-MS液质联用方法定量分析PRN的产量，进一步验证TLC薄层层析的结果。
2.2.2. 抗真菌活性等表型分析
在PDA平板中央接入直径为6 mm的板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌丝饼，在距菌中心2 cm处的同心圆上接种2 μL 28℃过夜培养的野生菌G3或∆rsmB突变株。25℃恒温培养4天，观察测量抑菌圈的大小。野生菌与RsmB突变株的蛋白酶和生物膜检测方法参见Liu et al.2016的方法 [9]。每个实验处理设置至少三个重复。
2.2.3. 群体感应信号分子的提取和TLC分析
参照李惠等方法 [13]，主要用乙酸乙酯提取不同细菌菌株的QS信号分子AHLs。然后取5 μl提取液点样于RP18、F254S反相TLC平板(德国Merck)，展开剂为甲醇:水 (60:40, V/V)。约4 h充分展开后，取出置于通风橱中干燥。待溶剂被蒸发后，干燥的TLC平板用混有C. violaceum CV026检测菌株的软琼脂(0.6% agar)覆盖。琼脂凝固后，置于密闭的容器中，于30℃恒温箱中培养过夜，观察结果并拍照。分别以合成的AHLs标准样品N-丁酰基高丝氨酸内酯BHL (N-butanoyl-homoserinelactone)、N-己酰基高丝氨酸内酯HHL (N-hexanoyl-homoserinelactone)和N-3-O-己酰基高丝氨酸内酯OHHL (N-3-oxo-hexanoyl- homoserine lactone)作对照 [7]。
2.3. 数据处理
每个实验处理至少设置3个重复，数据采用SPSS软件进行统计分析。
3. 结果与分析
3.1. RsmB sRNA 突变显著影响抗生素PRN的合成水平
首先TLC检测分析PRN提取物，结果显示△rsmB突变体通过TLC方法几乎检测不到PRN的生成，而野生菌G3形成明显的蓝紫色斑点，与标准样品一致。为了验证该结果的准确性，进一步采用LC-MS/MS方法定量分析了上述提取样品。图1表明，与野生菌G3 (2.28 × 106)相比，RsmB突变导致PRN合成水平急剧下降，∆rsmB突变体仅为野生菌PRN产量的0.034倍 (7.70 × 104)。以上实验数据说明，RsmB sRNA正调控PRN的生物合成。野生菌G3产生抗生素PRN的二级质谱鉴定图谱见图2。
Figure 1. HPLC analysis of PRN produced by strain G3 and the RsmB mutant
图1. HPLC分析菌株G3及其RsmB突变株的PRN产生水平
Figure 2. MS spectra of PRN produced by S. plymuthica G3
图2. 抗生素PRN液质联用鉴定图谱
3.2. RsmB sRNA正调控G3菌株对板栗疫病病原真菌的拮抗活性
如上所述，RsmB突变导致G3菌株合成抗生素PRN的能力显著下降，因而可能相应地影响其抗真菌活性。为了检验该假说，通过平板对峙方法分别检测了野生菌G3及其突变株∆rsmB对板栗疫病菌C. parasitica的拮抗活性。实验结果表明(图3)，与野生菌G3相比，RsmB突变株的抑菌圈明显减小，几乎消失不见，表明普城沙雷氏菌G3菌株的抑菌活性与其PRN合成的水平正相关。此外RsmB分别引起蛋白酶活性(图3右)和生物膜形成(图4)的减少，说明RsmB是作为全局调控子也正调控S. plymuthica G3菌株的其他生防相关表型。
Figure 3. RsmB upregulated antifungal activity and protease (right) in S. plymuthica G3
图3. RsmB正调控抗真菌活性和蛋白酶活性(右)
Figure 4. Mutation in RsmB was impaired in biofilm formation
图4. RsmB突变影响生物膜的形成
3.3. RsmB sRNA影响群体感应信号AHLs的积累
在假单胞菌属Pseudomonas相关菌株中，Rsm系统已经被证明影响AHL信号的积累 [3]。本研究中经薄层层析TLC定性分析，并组合使用紫色杆菌CV026检测，如图5所示，与野生菌G3相比，突变株∆rsmB产生AHL信号分子的水平明显下降。两次独立的LC-MS/MS分析证实了RsmB突变导致S. plymuthica 主要几种AHL信号(OHHL、BHL和HHL等)的产生均有明显下降(数据未显示)。
S1：BHL/HHL标样；S2：OHHL标样；1：野生菌G3样品；2：突变体∆rsmB样品
Figure 5. TLC bioassay of AHL production overlaid with CV026
图5. TLC平板检测AHL信号分子
4. 讨论
目前非编码小RNA在不同细菌种属中已经被广泛鉴定，普遍参与在转录后水平上全局调控细菌基因的表达。其中γ-变形杆菌中的Csr/Rsm系统sRNAs已知作为同源二聚体RNA结合蛋白CsrA/RsmA的拮抗剂，通过捕获阻遏蛋白CsrA/RsmA，从而释放其对靶标mRNA翻译的抑制，对于转录后基因表达的调控至关重要 [1] [2]。随着组学和RNA测序技术的迅猛发展，最近有报道在鼠伤寒沙门菌Salmonella typhimurium中通过CLIP-seq全基因组测序，进一步揭示了Csr/Rsm系统除了作为重要的转录后水平调控子，也可以通过影响大量转录因子的翻译进而广泛参与调节细菌基因的转录 [14]。在植物相关细菌中，抗生素对于细菌的生态适应性、竞争力，以及在与寄主植物的互作中均发挥了巨大作用。更重要的是，近期研究发现抗生素PRN 等自身也可以作为信号分子调控基因表达、影响细菌的生理和行为 [10]。尽管迄今氢氰酸和酚嗪等抗生素已经被证明是在细菌Gas/Rsm信号转导系统的控制之下，然而，广谱、不易产生抗药性的农用和医用抗生素硝吡咯菌素PRN是否也受Rsm系统的调控依然是未知的。我们的前期研究已经明确，AHL介导的QS全局转录调控系统是抗生素PRN产生所必需的 [7]。而且，添加外源AHL，组合luxABCD报告基因分析表明QS也影响prnABCD操纵子的转录 [10]。本研究通过突变分析RsmB表型，以及定性和定量分析其PRN、QS信号分子AHL的合成水平，证实了在Serratia属RsmB小RNA可以通过影响群体感应系统AHL信号分子的积累，进而在转录和翻译多个水平上参与精细控制抗生素PRN的生物合成，也相应影响内生菌G3的抗真菌活性。综上所述，细菌Csr/Rsm系统sRNAs可分别在转录和转录后水平上调控基因的表达是其保守的性质，也暗示了该系统作为关键调控子处于细菌级联调控网络的中心。该研究结果可为遗传改良生防菌的效率和稳定性提供新策略。
致谢
作者特别感谢英国诺丁汉大学M. Ca’mara教授和N. Halliday对LC-MS2和生物膜分析提供的支持。
基金项目
国家自然科学基金项目(NSFC No. 31240046)；公益性行业(农业)科研专项(201503110-12)。
NOTES
*作者贡献相同。
#通讯作者。