1. 引言
肺癌发病率在我国居民恶性肿瘤中居于首位 [1]，化疗是治疗肺癌的重要手段之一，而多西紫杉醇是治疗肺癌的重要临床用药 [2]，但还不能根治肺癌，疗效有待提高。多西紫杉醇属于紫杉烷类抗肿瘤药物，其治疗恶性肿瘤的作用机制为促使微管蛋白的聚合及阻止微管解聚，从而对肿瘤细胞的有丝分裂及增殖具有抑制功能 [3]。
L-精氨酸是一种非必需氨基酸，在体内是鸟氨酸循环的中间代谢产物 [4] [5]，研究表明其具有一定的抗肿瘤效应，低浓度的L-Arg可以促进癌细胞的生长，高浓度的L-Arg则可能通过生成高浓度的NO而抑制癌细胞的增殖和诱导癌细胞的凋亡 [6]。抗肺癌机制可能为通过抑制P13K/Akt信号通路激活来实现 [7]。由于L-精氨酸对肿瘤具有一定的疗效，且毒性较小 [8]，联合肺癌的临床用药多西紫杉醇治疗肺癌，有望具有协同效应。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
2.1.1. 材料与试剂
L-精氨酸(上海源叶生物科技有限公司)；多西紫杉醇(江苏恒瑞医药股份有限公司)；清洁级C57BL/6小鼠(哈尔滨医科大学附属二院动物中心)；75%酒精(天津市天力化学试剂有限公司)。
2.1.2. 试验仪器
ALC-1104型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；FLC-3型生物洁净工作台(北京东联哈儿仪器制造有限公司)；22R 型高速离心机(德国Heraeus Sepatech公司)；Eclipse TS100型培养倒立显微镜(Nikon公司)；E191IR型CO2细胞培养箱(美国西蒙有限公司)；紫外线杀菌灯车(江阴市飞扬器械有限公司)；Zf11-01型洁净动物饲养柜(东北林业大学植物药工程研究中心设计监制)。
2.2. 实验方法
2.2.1. 建立小鼠肺癌模型
本实验已获得动物实验伦理许可。为研究L-Arg和DTX联用的抗肺癌效果，首先建立小鼠肺癌模型 [9]。取指数生长期的Lewis肺癌细胞经胰蛋白酶消化后，用培养液调整细胞浓度1.0 × 109个细胞/L。将小鼠置于通风厨内操作台上，用体积分数为75%的酒精溶液消毒小鼠左腋下，取调整好浓度的Lewis肺癌细胞0.2 ml，接种于小鼠左腋下。
2.2.2. 药物制备
L-Arg溶液制备：称取600 mg L-Arg，取两支试管备用，将药品加入其中一支试管内，加1 ml生理盐水至溶解，用5 ml注射器取生理盐水加入试管定容到8 ml，最后过滤膜转移至另一试管中备用，得浓度为75 mg/ml的L-Arg溶液。
DTX溶液制备：称取5 mg DTX，取两支试管备用，将药品加入其中一支试管内，先加100 μl吐温80，再加200 μl乙醇溶解DTX后用生理盐水定容到10 ml，最后过滤膜转移至另一试管中备用，得浓度为0.5 mg/ml的DTX溶液。
2.2.3. 分组、给药及测量
将6周龄雌C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组，L-Arg组，DTX组，L-Arg和DTX联用组，每组6只。L-Arg组以1.5 g/kg给药剂量灌胃 [10]，DTX组以5 mg/kg给药剂量腹腔注射，L-Arg和DTX联用组给药方式为分别用上述方法给药。接种后隔3天测一次体重，每5天用游标卡尺测量一次肿瘤长径a
和短径b，按公式计算肿瘤体积
，计算每组瘤体积平均值，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，公式为：
。记录每组小鼠死亡时间，绘制小鼠生存曲线 [11]。
协同作用测定：金氏公式是金正均教授提出的可用于评价合并用药作用强度的公式，公式为：
，Ea为L-Arg单用时的肿瘤抑制率，Eb为DTX单用时的肿瘤抑制率，Ea+b为L-Arg
和DTX分别以各自单用剂量联合使用时的肿瘤抑制率。q > 1.15时，表示DTX和L-Arg联用产生协同作用，0.85 < q < 1.15时，表示L-Arg和DTX联用产生相互作用，q < 0.85时，表示L-Arg和DTX联用产生拮抗作用 [12]。
2.3. 数据分析方法
数据统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行Kaplan-Meier，One-way ANOVA和Kruskal-WallisH相关分析。
3. 结果与分析
3.1. 模型小鼠体重变化情况分析
造模后小鼠体重变化如图1，四组小鼠进食均减少，体重均下降，空白组由于肿瘤发展较快导致体重减轻较慢。联合用药作用体重下降较快，可能是肿瘤生长较缓慢导致的。空白对照组小鼠平均体重为18.69 ± 0.61 g，L-Arg组小鼠平均体重为18.35 ± 0.56 g，DTX组小鼠平均体重为18.18 ± 0.96 g，L-Arg和DTX联用组平均体重为17.29 ± 1.02 g，仅联用组与空白组相比有显著性差异(*P < 0.05)，暗示联用组小鼠肿瘤得到有效控制。
Figure 1. The weight change curve after modeling (*P < 0.05)
图1. 造模后小鼠体重变化曲线(*P < 0.05)
3.2. 模型小鼠瘤体积变化情况分析
小鼠肺癌模型建立8d后，各组小鼠均可见肿瘤生长，小鼠腋下均可触摸到肿块，且肿块随时间增加逐渐增大，肿瘤生长曲线如图2。L-Arg和DTX联用组小鼠肿瘤体积明显小于其他三组，L-Arg组肿瘤抑制率为37.75 ± 6.83%，DTX组为38.62 ± 1.41%，联用组为57.15 ± 7.61%，L-Arg和DTX联用组与L-Arg组和DTX组均有显著性差异(*P < 0.05)，经协同作用测定q = 0.97，说明L-Arg和DTX联用产生相互作用，即是说L-Arg和DTX的联用比单独用药更有效果，并且不会产生相互抑制而引起其他副作用。
Figure 2. The tumor growth curve after modeling (*P < 0.05)
图2. 造模后小鼠肿瘤生长曲线(*P < 0.05)
3.3. 模型小鼠生存期分析
小鼠造模后，每天观察小鼠的生存状态，精神状 态并记录生存期。对各组的小鼠采用SPSS 17.0软件中Kaplan-Meier法进行生存期分析，生存曲线如图3所示。空白对照组小鼠平均生存周期为24.20 ± 5.87 d，L-Arg组为28.00 ± 3.09 d，DTX组为29.60 ± 2.90 d，联合用药组为35.40 ± 6.26 d，L-Arg和DTX联用组与其他各组均有显著性差异(P = 0.003, P = 0.009, P = 0.038, *P < 0.05, **P < 0.01)，结果表明联合用药组生存期显著增长，所以L-Arg和DTX联用有延长小鼠生存期的作用。
Figure 3. Survival time curve of model mice (*P < 0.05, **P < 0.01)
图3. 模型小鼠的生存期曲线(*P < 0.05,**P < 0.01)
4. 讨论
研究抗肺癌的新疗法具有重要意义。DTX属于广谱抗肿瘤药物，活性是紫杉醇的2倍 [13]，具有较好的抗肺癌效果，常作为二线化疗药物用于非小细胞肺癌(NSCLC)的单药和联合治疗 [14]，其抗癌机制主要是阻滞细胞周期，从而诱导癌细胞发生细胞凋亡。单一药物化疗会产生耐药性，用药初期癌细胞迅速被杀灭，肿瘤体积明显缩小，但多次反复使用后癌细胞由于基因突变而产生化疗抵抗(耐药性)。
L-Arg不但有抗癌的作用，而且L-Arg在体外循环全身灌注中能够抑制中性粒细胞激活和对血管内皮的粘附，清除氧自由基，降低血液粘滞性，改善微循环，降低外周血管阻力。改善生物材料相容性，减轻全身炎症反应 [15]。
L-Arg的抗癌、低毒性及对机体的保护作用，与DTX的优秀的抗癌能力联合可以在即保证抗癌效果的同时，又能有效地延长小鼠的生存期，实验结果也进一步证明L-Arg与DTX联用的抗肺癌效果。
5. 结论
综上所述，本实验通过建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型，研究了L-Arg和DTX药物联用对小鼠肺癌的抑制作用，通过观察记录，将L-Arg和DTX联用组与空白对照组、L-Arg组和DTX组的小鼠体重、肿瘤体积和生存期进行比较发现联用药物组肿瘤生长速度减慢，提高了对肺癌的抑制率，最终延长了小鼠生存期，所以L-Arg和DTX药物联用为治疗肺癌提供了新的联合给药方法，为提高DTX治疗肺癌的疗效提供了新思路。
NOTES
*通讯作者。