1. 引言
支气管哮喘是一种异质性、慢性气道炎症为特征的疾病，主要特征是以慢性气道炎症、气道高反应性和气道重塑。钙离子作为细胞内第二信使，发挥着调节ASMCs兴奋–收缩耦联作用。ASMCs是导致气道重塑的主要构成因素之一，而ASMCs收缩及增殖与细胞内的钙离子浓度是密不可分，细胞内钙离子浓度升高对增加和维持ASMCs收缩起主要作用 [1]。本研究通过共聚焦技术，测定3组间SD大鼠支气管平滑肌荧光值、荧光面积，探讨钙离子浓度变化对冷热型哮喘影响及其可能的机制。
2. 实验材料和方法
2.1. 材料与方法
2.1.1. 实验动物
5~6周健康雄性大鼠，来源南京市江宁区青龙山动物繁殖场，生产许可证号(SCXK(苏)2017-0001)。
2.1.2. 主要设备
雾化机(粤华，WH-2000)，DMEM (Hyclone, SH30809)，冰箱(海尔，BCD-196TMPI)，T-25培养瓶(Corning, 430639)，CO2培养箱(Thermo fisher, 3131)，荧光倒置显微镜(Nikon, Ts2R)，拉制仪参数(RAMP-20)，微电极推制器(sutter, P-1000)，激光共聚焦显微镜(Zeiss, LSM710)，Flou-3AM (Solarbio, F8840)，DMEM/high (Hyclone, SH30022.01B)。
主要试剂：卵蛋白(sigma, A5503)，戊巴比妥钠(上海隆盛化工，CAS:57-33-0)，细菌脂多糖LPS (sigma, S0130)，氢氧化铝(上海凌峰化学，21645-51-2)，PBS (南京生兴生物，SN331)，I型胶原酶(Solarbio, C8140)，木瓜蛋白酶(sigma, P4762)，胰酶(Hyclone, SH30042.01)，牛血清白蛋白(BSA) (Hyclone, SH30070.03)，PBS (Hyclone, SH30070.03)。
2.1.3. 实验分组及模型建立 [2] [3] [4] [5]
本课题已通过医院伦理委员会审查。随机分组分为正常对照组、冷哮组、热哮组，每组各9只，饲养于SPF级动物实验室，恒温恒湿，模拟标准日夜系统(12 h光照/12 h黑夜)，予以自由饮食及饮水。热哮喘模型：大鼠自由摄食、饮水7天后开始造模。大鼠分别于造模第1、8天腹腔注射卵蛋白和氢氧化铝混悬液1 ml (含卵清蛋白100 mg和氢氧化铝干粉100 mg)致敏，同时0.4%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，用移液管鼻滴40 μL细菌脂多糖(LPS)稀释液入大鼠双侧鼻孔(终浓度400 μg/mL)，从第15天开始以1%卵蛋白溶液超声雾化诱喘，每次30 min，每日1次，连续7 d，以大鼠出现发热、烦躁、汗多、口渴、点头、节律性收腹样喘促等现象，提示模型复制成功。冷哮模型：第1、8天造模方法同热哮组。第15天开始，将大鼠放入雾化箱内，以1%卵蛋白超声雾化激发，每次20~30 min，每天1次，同时将大鼠放入寒冷箱内(0℃~2℃)，每次20分钟，每天1次，连续7天；上述方法将大鼠激发至哮喘发作，出现点头、身体颤抖、节律性收腹样喘促现象等，提示模型复制成功。造模成功后，继续雾化激发及寒冷刺激4周。正常对照模型：大鼠以生理盐水1 ml取代卵蛋白生理盐水混悬液进行腹腔注射。第15天开始，以生理盐水超声雾化激发，每次20~30 min，每天1次。
2.1.4. 支气管平滑肌的急性分离
腹腔注射大剂量戊巴比妥钠将大鼠处死后，将肺取出，置于含双抗的PBS中漂洗，分离大鼠两侧肺组织中3~4级支气管，剪成1 mm3大小的组织块。加入2 mg/ml I型胶原酶和2.5 mg/ml木瓜蛋白酶，置于37℃培养箱中消化90 min，常温，1000 rpm离心8 min，去除上清，加入0.125%胰酶37℃消化5 min，加入含血清的DMEM培养基终止消化，1000 rpm离心8 min，去除上清，加入含血清的DMEM培养基重悬细胞，用100目筛过滤(细胞筛)，用DMEM培养液反复冲洗、离心2次，即可得到含支气管平滑肌细胞的细胞悬液。将细胞悬液接种至T-25培养瓶中，放入培养箱中培养。3天后，更换培养基，待细胞长至80%~90%融合度时，使用胰酶将细胞消化下来接种至3个培养瓶中。培养2~3代的细胞用于实验。
2.1.5. 免疫组化鉴定
将分离的大鼠支气管平滑肌细胞铺板于培养皿内，制作细胞爬片，培养24 h后，去除培养液，PBS清洗后加入多聚甲醛固定30 min。吸去多聚甲醛后，PBS洗3次后加入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS洗3次，每次5 min，吸去PBS后加5% BSA封闭20 min (封闭电荷)。去除BSA液，每孔加入100 μL 1:200稀释的一抗，4℃过夜。PBS洗3次后每孔加100 μl的二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次后，每张切片加50~100 μl新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色。显色完全后，蒸馏水洗，苏木素复染，吸去苏木素，水洗，镜下拍照。
2.1.6. 钙离子浓度测定
将3种不同模型的细胞从培养箱中取出，去除培养基，加入2 ml PBS溶液，轻轻晃两次以去除培养基，去除PBS。向培养板中加Fluo-3/AM，置于37℃、5% CO2培养箱中避光孵育60 min。去除含有Fluo-3/AM的溶液，并用PBS清洗两遍。37℃下孵育10分钟，用激光共聚焦显微镜进行拍照。激发波长506 nm，发射波长526 nm。拍照结束后，使用ImageJ软件对每组细胞中钙离子荧光强度进行检测。检测出荧光值，对各组细胞荧光值进行统计分析。
2.1.7. 统计学处理
应用SPSS23.0统计软件，符合正态分布，用(
)表示，组间比较采用t检验和方差分析，方差齐用LSD，不齐用Games-Howell；不符合正态分布采用秩和检验，以中位数和四分位数表示，P < 0.05具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 大鼠气道平滑肌细胞的鉴定
如图1，镜下随机选取3个视野拍照，可见细胞呈长梭形，细胞质内呈棕色丝状为α-sma蛋白表达，由此可以证明该细胞确实为大鼠支气管平滑肌细胞。
(a) ×100 
(b) × 200 
(c) ×400
Figure 1. Bronchial smooth muscle cells in normal group at different multiples after separation.
图1. 分离后不同倍数下正常组支气管平滑肌细胞
3.2. 钙离子浓度测定
3.2.1. 荧光值方面比较
如表1，3组组间荧光值比较，有非常显著性差异(P < 0.01)。荧光值热哮组 > 冷哮组 > 正常组，正常组、冷哮组、热哮组两两比较，差异均显著(P < 0.01)。
Table 1. Comparison of fluorescence values of the three groups (n,) and pairwise comparison of normal group, cold wheeze group, and hot wheeze group
表1. 三组荧光值比较(n,
)及正常组、冷哮组、热哮组两两比较
三组组间比较，P < 0.01，△热哮组与正常组比较，P < 0.01，★冷哮组与正常组比较，P < 0.01，★★热哮组与冷哮组比较，P < 0.01。
3.2.2. 荧光值面积方面比较
如表2，三组组间荧光值面积比较，有差异，具有统计意义(P < 0.05)。荧光值面积，热哮组 > 冷哮组 > 正常组，正常组与热哮组相比，差异显著(P < 0.01)，正常组与冷哮组、热哮组与冷哮组相比较，差异无显著性(P > 0.05)。
Table 2. Area comparison of three groups (n,) and pairwise comparison of normal group, cold wheeze group and hot wheeze group
表2. 三组面积比较(n,
)及正常组、冷哮组、热哮组两两比较
三组组间比较，P < 0.05，△热哮组与正常组比较，P < 0.01，★冷哮组与正常组比较，P > 0.05，★★热哮组与冷哮组比较，P > 0.05。
3.2.3. 荧光值、荧光面积比较
如表3，正常组、哮喘组在荧光值比较，差异显著(P < 0.01)，具有统计意义；在荧光面积比较，有差异，具有统计学意义(P < 0.05)。
Table 3. Comparison of fluorescence value and area of normal group and asthma group (n,)/[M(P25, P75)]
表3. 正常组、哮喘组荧光值、面积比较(n,
)/[M(P25, P75)]
◆哮喘组 = 冷哮组 + 热哮组；正常组与哮喘组比较，荧光值，P < 0.01，荧光面积，P < 0.05。
4. 讨论
随着全球环境污染进一步加重，目前我国哮喘患者约3000万人，最新流行病学调查显示14岁以上人群患病率为1.24%，并呈上升趋势 [6]。支气管哮喘已成为影响人们生活质量的慢性呼吸系统疾病之一。哮喘的发病机制尚不十分清楚，其中气道慢性炎症被普遍认为是哮喘发病的本质，这种慢性呼吸道炎症与气道高反应性(AHR)相关。近年来，人们逐渐认识到ASMCs在介导哮喘的发病机制中的重要性。目前对于目前对于电压依赖性钙通道研究居多，随着离子通道研究日渐成熟，共聚焦技术的发展，采用共聚焦技术检测钙离子浓度变化，探讨Ryanodine (RyR)受体内钙浓度变化对支气管哮喘钙通道特性影响受到重视。
细胞内钙离子来源主要经由2个途径，一是由细胞内肌浆网/内质网内储存钙释放；二是外钙内流至胞内。肌浆网上释放钙主要通过RyR介导。平滑肌收缩时外钙内流诱导细胞肌浆网/内质网内的储存钙释放，是引起兴奋–收缩耦联的主要机制。有研究表明支气管哮喘气道高反应时ASMCs对多种刺激因素敏感性升高 [7]，支气管收缩剂引起的ASMCs收缩程度升高 [8] 与ASMCs内钙离子浓度相关。为了证明冷、热型哮喘引起钙浓度变化对ASMCs钙通道特性影响，由于细胞内钙离子浓度难以测定，我们通过共聚焦技术检测荧光值、荧光面积来反应了钙离子浓度。我们发现冷、热哮组的钙浓度增加，热哮组较冷哮组增加明显，说明冷热哮喘组的细胞内钙浓度增加，较正常情况下更容易引起支气管收缩。这可能与ASMCs受到外来刺激，激活RyR受体，受体兴奋使得钙通道开放而引起钙内流，细胞内钙转移至胞浆基质，胞浆钙浓度增高，肥大细胞内颗粒网状化且发生形态改变，释放介质，引起ASMCs收缩有关。哮喘病人气道ASMCs细胞内钙离子浓度增加可使得哮喘患者气道的ASMCs处于无收缩的活性增加状态。此时ASMCs虽然没有明显收缩，但却增加了ASMCs活性，处于一触即发的高敏状态，从而导致气道高反应性，即使轻微的刺激即可诱发气道的痉挛 [9]。王忠慧 [10] 等通过豚鼠研究支气管哮喘平滑肌钙通道特性，发现ASMCs活性增加可能与气道高反应性相关。这也进一步证实了钙离子浓度增加，是引起气道高反应性的主要因素。
本实验研究结果表明，荧光值、荧光面积，哮喘组均较正常组增高，说明中医虽有冷哮、热哮2个方面的证型，但它们都有与钙离子浓度增加相关，这就说明了，为什么有学者 [11]，不管是冷哮，还是热哮，均用小青龙汤治疗均能取效的原因；荧光值热哮钙离子浓度增加较冷哮明显。推测，热哮患者往往是感染后发病，感染也可能是导致钙离子浓度增加的原因，因而，热哮钙离子浓度增加明显。这也解释了，临床上虽然热哮患者，用小青龙汤能取效，但用小青龙汤加石膏汤效果更好。热哮组较冷哮组钙离子浓度更高，说明热哮气道高反应性，细胞刺激阈值更低，临证时更加注重对热哮患者的关注，而且在中医治疗上要更加注重对哮喘患者疏风解痉治疗。荧光面积寒热两型比较，没有显著性差异，从数值上分析，若加大样本量，可能会出现与荧光值一样的差异。采取有效措施降低钙离子浓度，减少平滑肌细胞收缩，这可以作为支气管哮喘治疗的靶点，也是进一步研究的方向。
基金项目
福建省自然科学基金，编号：2016J01566，福建省“林求诚(陈志斌)中医肺病学术流派传承工作室项目”。