大田基黄总黄酮含量测定及提取物抗乙肝病毒作用

Determination of Flavonoids and Anti-Heptitis B Virus Activity of Extracts from Lysimachia fortunei Maxim

摘要: 目的：测定大田基黄提取物中总黄酮含量，研究大田基黄不同提取物体外抗乙肝病毒作用。方法：采用大孔吸附树脂(D101)纯化工艺技术，对大田基黄提取物进行提纯，应用NaNO2-AlCl3显色法测定总黄酮含量；应用HepG2.2.15细胞系培养系统检测大田基黄提取物对HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果：经树脂纯化后的大田基黄提取物总黄酮含量达89.29%；大田基黄提取物对HBsAg表达有抑制作用，其中对HBsAg抑制作用差别较大。结论：大孔吸附树脂(D101)分离纯化大田基黄总黄酮效果显著；大田基黄提取物有体外抗乙肝病毒作用。

Abstract: Objective: To determinate the flavonoids’ content and the anti-hepatitis B virus (HBV) effect of the extracts from Lysimachia fortunei Maxim in vitro. Methods: Macroporous resin (D101) was used to isolate and purify the extracts of Lysimachia fortunei Maxim and the total flavonoids’ content was determinated by NaNO2-AlCl3 system. Then, the HepG2.2.15 cell line was used to investigate the anti-HBV effects of the extract from Lysimachia fortunei Maxim. Results: The content of flavonoids reaches 89.29%. The extracts are shown to inhibit the HBeAg secretion in HepG2.2.15 cells. Conclusions: Macroporous resin (D101) is efficient for purification of total flavonoids from Lysimachia fortunei Maxim. The extracts of Lysimachia fortunei Maxim are effective in inhibition of HBV in vitro.

1. 引言

大田基黄Lysimachia fortunei Maxim系报春花科排草属植物红根排草，别名星宿菜、红根草，系多年生植物，多发现于山边、沟坡、溪畔等湿润阴凉区域，在我国中南、华东等省均有分布。大田基黄全草富含黄酮类、甾体类化合物 [1] [2] [3] [4]，具有抗高血压、镇痛抗炎、提高免疫力等药理作用 [5] [6] [7]。黄酮类化合物属于植物二次代谢产物，具有多方面的活性 [8]，大田基黄富含黄酮类化合物 [9] [10]，可能是潜在的抗病毒活性物质。本实验测定了大田基黄提取物中的总黄酮含量，利用HepG 2.2.15 细胞系观察不同提取物对HBeAg、HBsAg分泌的影响，分析不同极性提取物的抗乙肝病毒功效。

2. 材料药品与仪器

2.1. 药品试剂

大田基黄全草，由广西植物研究所黄定中高工鉴定为报春花科排草属植物红根排草Lysimachia fortunei Maxim；芦丁标准品，AR，批号TCM027-080118，南京替斯艾么中药研究所；D101大孔吸附树脂(中国沧州远威化工有限公司)；HepG 2.2.15 细胞系(北京大学医学院第一附属医院病毒研究所)；DMEM G418 (Gibco分装)，谷氨酰胺(Sigma)，新生小牛血清(Sigma)；其他试剂为分析纯。

2.2. 仪器设备

BP211D电子天平，德国Sartorius公司产品；752紫外光栅分光光度计，上海分析仪器总厂产品；MCO -15AC CO₂培养箱，日本三洋公司产品；XSBIA倒置显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司产品；KHB ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司产品；96孔细胞培养板，美国Corning公司产品。

3. 方法

3.1. 总黄酮提取

大田基黄全草粉碎，过14目筛，取过筛物20 g，加60%乙醇200 mL超声提取0.5 h，抽滤，滤渣按相同条件再提取一次，合并滤液，减压浓缩至稠状物。稠状物加500 mL蒸馏水搅拌溶解，静置过夜，抽滤。取滤液上D101树脂柱，待大孔树脂吸附完全后，用蒸馏水洗脱至馏出液无色，弃去此柱流液。再用400 mL 80%乙醇洗脱树脂，收集洗脱液，旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液于真空干燥器中45℃干燥成疏松固体，粉碎得粗黄酮，备用。

3.2. 样品制备

干燥大田基黄全草粉碎，过14目筛，称取10 g用10倍量95%乙醇超声提取0.5 h，抽滤，滤渣同样条件再提取一次，合并滤液，浓缩、真空干燥得提取物E₁；滤渣用60%乙醇按上述方法处理得提取物E₂；上述滤渣用蒸馏水按上述方法处理得提取物E₃。

3.3. 总黄酮的含量测定

3.3.1. 标准曲线的制备

精确称量20.00 mg芦丁标准品，以60%乙醇超声溶解后，定容至50 mL容量瓶，取8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入浓度为0.50 mol/L的NaNO₂ 1.0 mL，摇匀静止5 min，再加入0.30 mol/L的AlCl₃ 1.0 mL，摇匀静置5 min，再加1.00 mol/L的NaOH 5.0 mL，摇匀显色后，用60%乙醇定容并摇匀，放置10 min，用1 cm比色皿在360~600 nm区间扫描，确定最大吸收波长为504.6 nm。分别移取上述标准液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于7个25 mL的容量瓶中，同上述方法显色后，用60%乙醇定容，于504.6 nm处测定吸光度，空白试剂为参比液，绘制标准曲线。

3.3.2. 精密度试验

取上述芦丁标准液5份，每份3.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，显色后用60%乙醇定容，测定5份溶液的吸光度值。

3.3.3. 稳定性试验

量取同一供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h处测定吸光度值，每一时间段测5次，计算RSD%。

3.3.4. 样品中总黄酮含量测定

精确称量粗黄酮干燥产物120 mg，用60%乙醇超声溶解，定容至50 mL容量瓶。再精密量取5.00 mL于25 mL容量瓶，按标准曲线制备方法加入试剂显色摇匀后，用60%乙醇定容放置10 min，测定吸光度，测定3次，并将此值代入回归方程，计算总黄酮的含量。

3.4. 总黄酮的体外抗乙肝作用

3.4.1. 药物配制

将大田基黄提取物E₁、E₂、E₃用100%二甲基亚砜溶解，使二甲基亚砜浓度为10%，过滤灭菌备用。

3.4.2. HepG2.2.15细胞的培养

DMEM中加入380 mg/L G418、15%新生小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素链霉素、5%碳酸氢钠调pH 7.2~7.4，于 37℃ 、5%二氧化碳条件下培养，每10 d传代一次。

3.4.3. 药物对细胞的毒性作用试验

将HepG 2.2.15 细胞按1 × 10⁸/mL接种于96孔细胞培养板，每孔190 μL，置CO₂培养箱培养30 min，酶标仪于波长515 nm条件下测其吸光度。依次将提取物E₁、E₂、E₃各50 μL加入培养板中，每3 d换相同浓度的相同药液和培养基，设不加药物的100 mL/L DMSO为对照孔，于第9天测定药物对细胞的毒性。

3.4.4. 大田基黄提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响

将HepG 2.2.15 细胞按2 × 10⁵/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔190 μL，加入不同浓度提取物E₁、E₂、E₃，每个浓度设3个平行孔，同时设10% DMSO阴性对照组，3天后取培养孔上清液用ELISA法测定吸光度值，计算药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率。

3.4.5. 统计处理

各组检测数据以 $\bar{\mathrm{x}}$ ± s表示，组间比较用t检验。

4. 结果

4.1. 方法试验

精密度试验：5份芦丁标准液，吸光值分别为0.135、0.135、0.135、0.136、0.135，平均值为0.1352，RSD% = 0.33，显示精密度良好。

稳定性试验：0~8 h不同时间点吸光度值RSD%分别为0.18、0.28、0.19、0.17、0.15、0.28、0.36、0.43、0.67，统计结果表明，在8h内试验结果稳定性良好，检测方法可行。

4.2. 黄酮含量测定

测定提取物中总黄酮含量3次，平均含量为89.29%。

4.3. 提取物对HepG 2.2.15 细胞系的作用

大田基黄提取物体外抗乙肝病毒作用，提取物E₁为60%乙醇提取物，提取物E₂为大田基黄95%乙醇提取物，提取物E₃为95%乙醇提取完后再用水提取。72h的抑制结果见表1、表2和表3。提取物对HBeAg分泌具有较好的抑制作用，对HBsAg的分泌作用影响有差异，仅提取物E₂具有较好的抑制作用。三种提取物对HBeAg的抑制作用呈现剂量性关系，E₂对HBsAg的抑制作用也呈现出抑制作用。

Table 1. Effects of extract E1 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )

表1. 提取物E₁对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\bar{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

Table 2. Effects of extract E2 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )

表2. 提取物E₂对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\bar{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

Table 3. Effects of extract E3 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )

表3. 提取物E3对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\bar{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

5. 讨论

乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，肝脏感染后产生炎性病变，具有传染性。乙肝病毒感染者血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)呈阳性，是感染HBV的标志。乙型肝炎E抗原(HBeAg)是判断HBV复制活跃与否的重要标志，其存在于HBsAg阳性患者的血液中，HBeAg呈阳性反映HBV病毒复制活跃、传染性强。目前，抗乙型肝炎药物主要有α-干扰素和核苷类似物两大类，但是其治疗效果并不令人满意，而且具有类感冒、疲倦和低血球等副作用 [11] [12]。传统中药作为一种补充替代疗法，在临床上中国、日本和韩国等多个国家广泛应用其治疗乙型肝炎 [13]。传统中药活性因子复杂多样，很多活性因子没有完全分离纯化，结构没有阐明，但是由于其来源广泛，而且化学特征与生物合成或者化学合成药物类似，易吸收、代谢，因此近年来传统中药引起了药物研究者的广泛关注 [14]。

黄酮类化合物是一类发现于植物的酚型结构次生代谢产物，种类繁多，活性多样。多种黄酮被证实对乙型肝炎具有治疗作用，茶叶中富含EGCG，其能够破坏HBV DNA复制中间体的合成从而抑制HBV 复制，最终减少共价环状病毒DNA链的表达 [15]。汉黄芩素和5-甲氧基-(3,4-二氢-3,4-二乙酰氧基)-2,2'-二甲基-吡喃酮-(7,8,5,6)-黄酮降低HBsAg和HBeAg分泌水平，同时降低HBV DNA表达，从而抑制HBV复制 [16] [17]。苎麻叶提取物含黄酮类化合物，对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA表达都有显著抑制作用 [18]。

大田基黄中槲皮素含量达3.25 mg/g，总黄酮含量高达3.83%，黄酮含量丰富，以大孔树脂D101富集纯化效率较高 [9] [10]。已经鉴定的黄酮类化合物有5000多种，包括无糖基的苷元和连接有糖基的苷。不同黄酮类化合物极性不同，溶解于有机溶剂的特性也不同，苷元和连接较少糖基的苷极性小，容易溶解于高浓度乙醇溶液中，含有稍多糖基的苷极性中等，比较容易溶解于中等浓度乙醇溶液，当苷中糖基数目比较多时极性较大，比较容易溶解在水中。所以利用95%乙醇提取出极性较小的黄酮苷元和黄酮苷E₁，60%乙醇溶液提取出中等极性黄酮苷E₂，水提取出极性大的黄酮苷E₃。

本实验以乙型肝炎病毒感染肝癌细胞得到的细胞系HepG 2.2.15 为体外研究模型，检测了HBsAg、HBeAg的表达水平，观察了大田基黄三种提取物不同浓度体外对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。结果表明，提取物E₂、E₃仅对HBeAg表达有抑制作用，提取物E₁对HBsAg与HBeAg均有抑制作用，且其抑制作用呈现剂量依赖性。三种提取物极性不同，表明其所含糖基数目不等，但均对HBeAg有抑制作用，且抑制作用相差不大，从构效角度表明苷元糖基存在与否对HBeAg表达影响不大，糖基对HBeAg的抑制作用不是必须的。但是糖基的存在对抑制HBsAg表达存在较大差异，提取物E₁极性较小，说明其含糖基数目少，有较好的抑制HBsAg表达作用，而提取物E₂、E₃极性较大，对HBsAg表达的抑制较弱，说明糖基的存在不利于抑制HBsAg表达。

基金项目

北部湾大学校级科研项目(2017KYQD223)，广西高校科学技术研究项目(KY2015ZD086)。