一种基于甲酰基香豆素识别Cys/Hcy的荧光性能研究

Study on the Fluorescence Properties of Cys/Hcy Based on Formyl Coumarin

摘要: 设计、合成了一种基于甲酰基识别L-半胱氨酸(Cys)和L-高半胱氨酸(Hcy)的香豆素荧光探针。该探针在HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v), pH = 7.1)中，对Cys和Hcy具有良好的选择性和较高的灵敏度。探针耐酸碱，在2~10的广泛pH区域内，对Cys和Hcy仍表现出良好的识别效果。在探针溶液中加入等当量的Cys或Hcy后，体系荧光强度增强2~3倍，响应时间分别为30 min、20 min。10当量其它常见氨基酸对其检测无干扰，对Cys和Hcy的最低检测限分别达到5.7 × 10⁻⁷ mol/L和5.2 × 10⁻⁷ mol/L。

Abstract: A coumarin fluorescent probe based on formyl recogniting L-cysteine (Cys) and L-homocysteine (Hcy) was designed and synthesized. The probe has good selectivity and high sensitivity to Cys and Hcy in HEPES buffer (EtOH:H₂O = 8:2 (v:v), pH = 7.1). The probe is resistant to acids and al-kalis, and still shows good recogniting effect on Cys and Hcy in a wide pH range of 2~10. After adding equivalent Cys or Hcy to the probe solution, the fluorescence intensity of the system en-hances 2~3 times, responsing time is 30 min, 20 min. 10 equivalents of other common amino acids have no interference on the detection. The lowest detection limits are 5.7 × 10⁻⁷ mol/L and 5.2 × 10⁻⁷ mol/L.

1. 引言

半胱氨酸(Cysteine，简称Cys)、高半胱氨酸(Homocysteine，简称Hcy)是生物体内的两种含巯基的重要氨基酸，参与生命代谢过程，对细胞生长和组织分化起着至关重要的作用 [1] [2] [3]，其在细胞中含量的异常与许多疾病密不可分。Cys存在于多种蛋白质和多肽中，具有淡化黑色素、延缓衰老、促进体制生长等作用 [4] [5]，人体缺乏Cys，会导致生长缓慢 [6] 、毛发褪色、组织水肿 [7] 、肝功能损伤 [8] 、皮肤损伤 [9] 等。Hcy与Cys分子结构相似，在体内含量较高，同样是生物体中不可或缺的一种氨基酸，血液中Hcy含量过高，会导致肾功能受损、认知功能障碍 [10]，严重时甚至会出现阿尔茨海默病和精神分裂症 [11] [12]。此外，Cys和Hcy的含量异常也是诱发心脑血管疾病的重要因素 [13] [14]。因此，对这两种氨基酸的分析检测具有重要的生理和病理意义。目前，检测这两种氨基酸的主要分析技术包括高效液相色谱法(HPLC) [15] 、毛细管电泳(CE) [16] 、电化学检测(ECD) [17] 等，但这些分析方法普遍存在实验条件苛刻、操作繁琐、区分不明显、实验成本高等缺点，荧光探针检测法因其操作简单(样品无需预处理)、区分明显、检测快捷有效、成本低等优点，而受到广大研究者的青睐。几种主要检测Cys/Hcy的分析技术具体性能对比如表1所示。

Table 1. Comparison of several major technologies of Cys/Hcy

表1. 几种主要检测Cys/Hcy技术对比

基于荧光探针检测法的以上突出优点，本文设计开发了一种结构简单、可快速检测Cys和Hcy的香豆素荧光探针(即探针A)，该探针对Cys和Hcy具有良好的选择性和抗干扰性，响应灵敏。

2. 实验部分

2.1. 实验仪器与试剂

仪器：85-2A型磁力搅拌器，分析天平，SHZ-D (III)型真空泵，RV 10 basic V型蒸发仪，ZF-I型三用紫外分析仪，B-4型pH计，真空隔膜泵，PY-1型熔点仪，Fluoromax-4荧光光谱仪，7600CRT紫外分光光度仪，Bruker AM400核磁共振仪。

试剂：所用试剂均为分析纯，其中无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、间苯二酚、三氟乙酰乙酸乙酯和氘代氯仿购自上海泰坦科技股份有限公司；甲苯、乌洛托品、浓盐酸、无水硫酸镁和L-半胱氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；HEPES和L-同型高胱氨酸购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2. 探针A的合成

探针A的合成路线如图1所示，以间苯二酚和三氟乙酰乙酸乙酯为原料合成4-三氟甲基-7-羟基香豆素，再通过Duff反应制备4-三氟甲基-7-羟基-8-甲酰基香豆素，即探针A。

Figure 1. Synthesis route of probe A

图1. 探针A的合成路线

2.2.1. 4-三氟甲基-7-羟基香豆素(化合物1)的合成

向100 mL三口烧瓶中加入甲苯(20 mL)、间苯二酚(2.21 g, 20 mmol)和三氟乙酰乙酸乙酯(3.57 g, 20 mmol)，再加入碘(0.51 g, 2 mmol)作为引发剂以及2 mL浓盐酸，60℃下搅拌溶解，升温至85℃，继续搅拌6 h。反应完毕后，加入冰水，固体析出，抽滤，得到产物4-三氟甲基-7-羟基香豆素3.64 g (粉色固体)，产率为79.1%。Mp：177℃~179℃ (文献值 [18] ：178.4℃~179.3℃)。

2.2.2. 4-三氟甲基-7-羟基-8-甲酰基香豆素(探针A)的合成

在100 mL三颈瓶中加入4-三氟甲基-7-羟基香豆素(2.31 g, 10 mmol)和乌洛托品(7.01 g, 50 mmol)，倒入20 mL冰乙酸。升温至90℃，继续搅拌7 h，之后用质量分数为10%的盐酸调节溶液的pH至2~3，继续反应40 min。反应结束后冷却至室温，加入冰水，之后用二氯甲烷萃取3次(20 mL × 3次)，干燥，柱层析纯化，洗脱剂PE:EA = 12:1，得到探针A的淡黄绿色固体0.68 g，产率为26.4%。Mp: 109℃~112℃. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.39 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 7.86 (dd, J = 9.2, 1.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 192.82, 166.19, 157.39, 141.78, 133.16, 122.65, 119.91, 115.68, 112.53, 108.96, 105.59. ¹⁹F NMR (377 MHz, CDCl₃) δ-64.72. ESI-MS: m/z 257.0 (M⁺ − 1)。

3. 结果与讨论

3.1. 探针A的结构表征

3.1.1. ¹H NMR表征

化合物经Bruker AM400核磁共振仪测试，得到¹H NMR图(图2)。如图2所示，化合物有5个H，符合探针A的结构。δ 12.39 (s, 1H)为香豆素7位酚羟基的H；10.63 (s, 1H)为香豆素8位-CHO的H；7.86 (dd, J = 9.2, 1.6 Hz, 1H)为香豆素5位苯环的H，因受到6位H和4位-CF₃的F影响，裂分为四重峰；7.01 (d, 1H)为香豆素6位苯环的H，受到5位H的影响，裂分为二重峰；6.73 (s, 1H)为香豆素3位上的H。

Figure 2. ¹HNMR chart of Compound A

图2. 化合物A ¹H NMR图

3.1.2. ¹³C NMR表征

化合物经Bruker AM400核磁共振仪测试，得到¹³C NMR图(图3)。如图3所示，化合物有11个C，符合探针A的结构。δ 192.82为香豆素8位相连-CHO的C；166.19为香豆素2位-C=O的C；157.39为香豆素7位的C；141.78为香豆素4位的C；133.16为香豆素9位上的C；122.65为香豆素5位上的C；119.91为-CF₃的C；115.68为香豆素8位上的C；112.53为香豆素10位上的C；108.96为香豆素6位上的C；105.59为香豆素3位上的C。

Figure 3. ¹³C NMR chart of Compound A

图3. 化合物A ¹³C NMR图

3.1.3. MS表征

化合物经HPLC-MS测试，得到质谱图(图4)。如图4所示，m/z 257.0 (M⁺ − 1)。

Figure 4. Mass spectrum of Compound A

图4. 化合物A质谱图

3.2. 探针A在不同比例的乙醇与水中的荧光性能

如图5所示，当乙醇与水的体积比为9:1或8:2时，探针A在502 nm处荧光最强，此后随着体系中水含量的升高，荧光强度逐渐降低，比例为1:9时，荧光强度最低。因此，测试溶剂乙醇与水的比例为8:2时最合适。

Figure 5. The fluorescence emission spectra of probe A (20 μM) in different ratios of ethanol and water. The volume ratios of EtOH:H₂O from top to bottom are 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, ${\lambda }_{ex}$ = 341 nm

图5. 探针A (20 μM)在不同比例的乙醇和水中的荧光发射光谱，从上到下EtOH:H₂O体积比分别为9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, ${\lambda }_{ex}$ = 341 nm

3.3. 探针A对Cys/Hcy的有效识别

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，分别加入等当量的Cys和Hcy溶液(浓度为20 μmol/L)，测试得到紫外吸收光谱图(图6)和荧光发射波谱图(图7)。

Figure 6. UV absorption spectrum of probe A after adding Cys/Hcy

图6. 加入Cys/Hcy后探针A的紫外吸收光谱

Figure 7. Fluorescence emission spectrum of probe A after adding Cys/Hcy (embedded image is fluorescence change of the system under 365 nm irradiation)

图7. 加入Cys/Hcy后探针A的荧光发射光谱(内嵌图为365 nm紫外灯下，加入Cys/Hcy后体系荧光变化图)

如图7所示，加入Cys/Hcy后，探针的最大吸收峰从365 nm蓝移至341 nm，且吸收峰强度有所增强，在395 nm附近吸收峰强度明显减弱。如图8所示，当激发波长λ_ex = 341 nm，发射波长λ_em = 502 nm时，加入Cys和Hcy后体系的荧光强度增强了约2.5倍。探针A识别Cys和Hcy效果良好，可作为检测Cys和Hcy的荧光探针。

3.4. 探针A的选择性测试

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，分别加入等当量(浓度为20 μmol/L)的Cys、Hcy、GSH、Gly、Glu、Val、Tyr、Arg、Try、Lys、His、Leu、Phe、Asp、Met 15种氨基酸，测试得到荧光发射波谱图(图8)。

如图8所示，当激发波长λ_ex = 341 nm，发射波长λ_em = 5502 nm时，加入Cys和Hcy后体系的荧光强度增强了约2.5倍，色氨酸(Try)和赖氨酸(Lys)荧光强度稍有降低，降低约30%，其他氨基酸无变化。

Figure 8. Fluorescence emission spectrum of probe A after adding different amino acids

图8. 加入不同氨基酸后探针A的荧光发射光谱

3.5. 探针A检测Cys/Hcy的抗干扰性测试

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy(浓度均为20 μmol/L)，再分别加入10当量(浓度为200 μmol/L)的GSH、Gly、Glu、Val、Tyr、Arg、Try、Lys、His、Leu、Phe、Asp、Met 13种干扰性氨基酸，测试得到探针A检测Cys/Hcy的抗干扰性荧光波谱图(图9、图10)。如图9所示，其它13种氨基酸均不干扰探针A对Cys的检测，说明探针A检测Cys的抗干扰性良好。如图10所示，其它13种氨基酸均不干扰探针A对Hcy的检测，说明探针A检测Hcy的抗干扰性也良好。

Figure 9. Effect of different amino acids on detection of Cys by probe A

图9. 不同氨基酸对探针A检测Cys的影响

Figure 10. Effect of different amino acids on the detection of Hcy by probe A

图10. 不同氨基酸对探针A检测Hcy的影响

3.6. 探针A对Cys/Hcy的响应时间测试

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy (浓度为20 μmol/L)，每隔3分钟检测一次体系荧光强度，得到探针A对Cys/Hcy的响应时间曲线图(图11、图12)。如图11所示，在加入Cys 30 min后，体系荧光基本达到饱和，说明等当量探针A对Cys的响应时间约30 min。如图12所示，在加入Hcy 20 min后，体系荧光基本达到饱和，表明等当量探针A对Hcy的响应时间约20 min。说明探针A对Hcy的检测较Cys更灵敏。

Figure 11. Responsing time curve of detection of Cys by probe A (embedded image is the fluorescence emission spectrum of responsing time of detection of Cys by probe A, λ_ex = 341 nm)

图11. 探针A对Cys响应时间曲线(内嵌图为A对Cys响应时间荧光发射谱图，λ_ex = 341 nm)

Figure 12. Responsing time curve of detection of Hcy by probe A (embedded image is the fluorescence emission spectrum of responsing time of detection of Hcy by probe A, λ_ex = 341 nm)

图12. 探针A对Hcy响应时间曲线(内嵌图为A对Hcy响应时间荧光发射谱图，λ_ex = 341 nm)

3.7. pH对探针A识别Cys/Hcy的性能影响

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入等当量的Cys或Hcy (浓度均为20 μmol/L)，测定了pH从1~13时探针A对Cys或Hcy的识别性能影响，得到pH对探针A识别Cys/Hcy的性能影响图(图13、图14)。如图13所示，当pH = 2~10时，探针A对Cys具有良好的识别效果，最佳pH为6；当pH = 1或11时，探针A对Cys基本没有识别效果；当pH ≥ 12时，荧光猝灭，推测可能是探针在此条件下分子结构已遭到破坏。如图14所示，当pH = 2~10时，探针A对Hcy具有良好的识别效果，最佳pH为5；当pH = 1时，探针A对Hcy基本没有识别效果；当pH = 11时，荧光强度减弱约50%，无识别效果；当pH ≥ 12时，荧光猝灭，推测可能是探针的分子结构已被破坏。所以，探针A识别Cys/Hcy的适宜pH范围为2~10，在弱酸性体系(pH约5~6)下，测试效果最佳，探针的耐酸碱能力较强，稳定性较好。

Figure 13. Effect of pH on the performance of probe A in identifying Cys

图13. pH对探针A识别Cys的性能影响

Figure 14. Effect of pH on the performance of probe A in identifying Hcy

图14. pH对探针A识别Hcy的性能影响

3.8. Cys/Hcy浓度对探针A荧光强度的影响

3.8.1. Cys浓度对探针A荧光强度的影响

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A浓度为20 μmol/L)体系中，加入浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μmol/L的Cys溶液，测得Cys浓度梯度对探针A荧光强度的影响图(图15)。如图15所示，随着Cys浓度的增加，体系荧光强度逐渐增大。将混合溶液体系在502 nm处的荧光强度对Cys的浓度作图，并进行线性拟合，得探针A随Cys浓度增大的荧光强度线形图(图16)。如图16所示，在加入2~20 μmol/L Cys后，荧光强度与浓度呈良好的线性增长关系，线性方程为y = 143272.72727x + 5482000 (相关系数R² = 0.99221)。根据最低检测限浓度计算公式C = 3S/K得，最低检测浓度为5.7 × 10⁻⁷ mol/L，说明该探针对Cys的检测较灵敏。

Figure 15. Change of fluorescence intensity of probe A with increasing Cys

图15. 探针A随Cys浓度增大的荧光强度变化图

Figure 16. Line graph of fluorescence intensity of probe A with increasing Cys

图16. 探针A随Cys浓度增大的荧光强度线形图

3.8.2. Hcy浓度对探针A荧光强度的影响

在探针A的HEPES缓冲液(EtOH:H₂O = 8:2 (v:v)，pH = 7.1，A4浓度为20 μmol/L)体系中，加入浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μmol/L的Hcy溶液，测得Hcy浓度梯度对探针A荧光强度的影响图(图17)。如图17所示，随着Hcy浓度的增加，体系的荧光强度逐渐增大。将混合溶液体系在502 nm处的荧光强度对Hcy的浓度作图，并进行线性拟合，得探针A随Hcy浓度增大的荧光强度线形图(图18)。如图18所示，在加入2~20 μmol/LHcy后，荧光强度与浓度呈良好的线性增长关系，线性方程为y = 157212.12x + 6150670 (相关系数R² = 0.99898)。根据最低检测限浓度计算公式C = 3S/K得，最低检测浓度为5.2 × 10⁻⁷ mol/L，说明该探针对Hcy的检测较Cys更灵敏。

Figure 17. Change of fluorescence intensity of probe A with increasing Hcy

图17. 探针A随Hcy浓度增大的荧光强度变化图

Figure 18. Line graph of fluorescence intensity of probe A with increasing Hcy

图18. 探针A随Hcy浓度增大的荧光强度线形图

4. 结论

本文设计并合成了一种基于甲酰基识别Cys和Hcy的香豆素荧光探针A。该探针合成路线简捷、结构简单，在HEPES缓冲液(EtOH:H₂O =8:2 (v:v)，pH = 7.1)中对Cys和Hcy具有良好的选择性和抗干扰性。探针耐酸碱，在2~10的广泛pH区域内，对Cys和Hcy仍表现出良好的识别效果。响应时间分别为30 min、20 min，且检测限分别为5.7 × 10⁻⁷ mol/L、5.2 × 10⁻⁷ mol/L，可用于快速检测Cys和Hcy。

NOTES

^*通讯作者。