摘要:
目的：探讨过敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura, HSP)患儿急性期血清可溶性细胞毒性T细胞相关抗原-4 (sCTLA-4)的水平变化及意义。方法：选择2017年12月至2018年5月期间住院治疗的HSP患儿49例为研究对象(HSP组)，62名健康儿童为正常对照组(对照组)，应用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HSP患儿和对照组儿童血清sCTLA-4的浓度。结果：HSP组患儿急性期血清sCTLA-4水平为(3749.5 ± 804.5) pg/ml；明显低于对照组[(5101.8 ± 566.7) pg/ml]，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。有/无前驱感染的HSP患儿血清sCTLA-4水平分别为(3446.1 ± 773.2) pg/ml和(4065.6 ± 723.0) pg/ml (P > 0.05)，有/无早期肾损害的HSP组患儿血清sCTLA-4水平分别为(3801.6 ± 839.7) pg/ml和(3724.3 ± 799.0) pg/ml，急性期有/无消化道症状的HSP患儿血清sCTLA-4水平分别为(3927.8 ± 242.3) pg/ml和(3670.9 ± 126.9) pg/ml (P > 0.05)，各组间差异均无统计学意义(P均 > 0.05)。HSP组患儿急性期血清sCTLA-4水平与免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、IgE水平间均无明显相关性(r = −0.172~0.187，P均 > 0.05)。结论：HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平降低，T细胞抑制信号不足，提示sCTLA-4在儿童HSP的发病机制中可能发挥一定作用。
Abstract:
Objective: To investigate the changes and significance of serum soluble cytotoxic t-cell-associated antigen-4 (sCTLA-4) in patients with Henoch-Schonlein purpura (HSP) in acute phase. Methods: 49 children hospitalized with HSP from December 2017 to May 2018 were selected as study subjects (HSP group), and 62 healthy children were selected as normal control group (control group). Serum sCTLA-4 concentrations of children with HSP and control group were detected by double-antibody sandwich ELISA. Results: The serum sCTLA-4 level in HSP group was (3749.5 ± 804.5) pg/ml. It was significantly lower than the control group [(5101.8 ± 566.7) pg/ml], and the difference was statistically significant (P < 0.01). Serum sCTLA-4 levels in children with/without prodrome infection were (3446.1 ± 773.2) pg/ml and (4065.6 ± 723.0) pg/ml (P > 0.05), respectively. Serum sCTLA-4 levels in children with/without early renal damage in the HSP group were (3801.6 ± 839.7) pg/ml and (3724.3 ± 799.0) pg/ml, respectively. Serum sCTLA-4 levels of HSP children with/without gastrointestinal symptoms in the acute phase were (3927.8 ± 242.3) pg/ml and (3670.9 ± 126.9) pg/ml (P > 0.05), respectively, and there was no statistically significant difference between each group (all P > 0.05). There was no significant correlation between serum sCTLA-4 levels and immunoglobulin IgA, IgG, IgM, IgE levels in HSP group (r = −0.172 - 0.187, all P > 0.05). Conclusion: Serum sCTLA-4 level in children with HSP in acute phase is reduced, and T cell inhibition signal is insufficient, suggesting that sCTLA-4 may play a certain role in the pathogenesis of HSP in children.
1. 引言
过敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura, HSP)，是儿童时期常见的一种系统性血管炎性疾病，临床主要表现为非血小板减少性皮肤紫癜，常伴关节痛、腹痛、便血及血尿或蛋白尿等。其病因及发病机制迄今尚未完全阐明。既往的临床及流行病学观察发现感染与HSP发病有关。实验研究亦提示HSP患儿异常增高的炎症细胞因子、趋化因子或循环免疫复合物(CIC)参与其发病，但感染导致免疫功能紊乱的机制仍不清楚 [1]。目前认为，HSP主要与细菌、病毒、食物、药物等各种抗原刺激导致机体免疫功能紊乱有关。普遍研究认为HSP患儿体内存在T淋巴细胞相关的免疫紊乱 [2]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4)属B7分子家族，是淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的配体蛋白分子，又称CD152，它属于免疫球蛋白超家族成员。CTLA-4分子是激活的CD4+ CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞表达的，通过与CD28竞争性与抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APCs)表面的B7分子结合，负性调控T细胞增殖与活化、诱导T细胞耐受。sCTLA-4是CTLA-4的可溶形式，与细胞膜表面CTLA-4一样，通过与CD28竞争性结合APCs表面的B7分子，干扰共刺激信号途径来干扰T细胞的活化。已有研究显示，sCTLA-4与多种免疫性疾病相关，如自身免疫性甲状腺疾病 [3]、系统性红斑狼疮 [4]、克罗恩病 [5] 等。有关儿童HSP血清CTLA-4水平变化的文献资料较少。本研究采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平进行检测，旨在观察HSP患儿血清sCTLA-4水平变化特点，以探讨CTLA-4在儿童HSP的发病机制中的作用。
2. 对象与方法
2.1. 研究对象
1) HSP组：2017年12月至2018年5月期间住院治疗的HSP患儿49例作为研究对象，其中女26例，男23例，年龄为(7.80岁 ± 2.90)岁，所有HSP患儿均符合2012年10月中华医学会儿科分会免疫学组制定的儿童过敏性紫癜循证诊治建议中的HSP的诊断标准 [6]。参照中华医学会儿科学分会肾脏病学组制定的儿童紫癜性肾炎诊治循证指南中的紫癜性肾炎的诊断标准 [7]。依据患儿急性期和缓解后4周内尿常规有无异常分为有肾损害组和无肾损害组，其中有肾损害组16例：男5例，女11例，年龄为(8.94 ± 2.29)岁，无肾损害组33例：男17例，女16例，年龄为(8.94 ± 2.3)岁。依据疾病急性期患儿主诉有无腹痛、血便或/和呕血症状，或大便常规异常，或腹部CT有肠套叠等消化道症状，分为有、无消化道症状组。前者共15例，其中男7例，女8例，平均年龄8.20岁 ± 3.1岁；无消化道症状组患儿34例，其中男16例，女18例，平均年龄7.62岁 ± 2.83岁。根据病前可能的诱因分为有、无前驱感染组。前者25例，其中男9例，女16例，平均年龄7.84岁 ± 2.85岁；无前驱感染组患儿24例，其中男14例，女10例，平均年龄7.75岁 ± 3.0岁。所有患儿采血前4周内均未使用任何糖皮质激素以及其他的免疫抑制剂，所有患儿无其他自身免疫性疾病、过敏性疾病病史。
2) 对照组：选取同期在青岛大学附属儿童保健科和体检中心查体的健康儿童62名作为正常对照组，其中男52例，女10例，年龄为(6.87 ± 2.76)岁。性别、年龄构成与HSP组差异无显著性。
本研究所有受试对象均已取得家属知情同意。
2.2. 检测方法
HSP组患儿与对照组儿童均空腹采血3 ml，将离心管及样品管平衡放置于离心机后，设置合适转速，大约离心20分钟后收集上层血清置于−80℃冰箱中保存待检。采用ELISA方法检测血清sCTLA-4水平，试剂盒系北京冬歌博业生物科技有限公司生产，主要操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
2.3. 统计方法
结果使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用平均数 ± 标准差
)表示，两组数据的比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。sCTLA-4与免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、IgE之间的关系分析采用直线相关性分析。
3. 结果
3.1. HSP组急性期血清sCTLA-4水平变化
HSP组患儿急性期血清中sCTLA-4水平为(3749.5 ± 804.5) pg/ml，正常对照组为(5101.8 ± 566.7) pg/ml，HSP组明显低于对照组，差异有显著性统计学意义(t = 8.722, P <0.01)。
3.2. 有/无前驱感染HSP患儿间血清sCTLA-4表达水平比较
有前驱感染组HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平为(3446.1 ± 773.2) pg/ml，无前驱感染组HSP患儿血清sCTLA-4水平为(4065.6 ± 723.0) pg/ml，两者之间差异无统计学意义(P > 0.05)。与对照组比较sCTLA-4水均明显降低。
3.3. 有/无肾损害HSP患儿血清sCTLA-4水平的比较
有早期肾损害的HSP患儿组急性期血清sCTLA-4水平为(3801.6 ± 839.7) pg/ml而早期无肾损害HSP患儿组血清sCTLA-4水平为(3724.3 ± 799.0) pg/ml，两者间差异无显著性统计学意义(t = 0.564, P > 0.05)。
3.4. 有/无消化道症状HSP患儿血清sCTLA-4表达水平比较
有消化道症状组HSP患儿血清sCTLA-4水平为(3927.8 ± 242.3) pg/ml，无消化道症状组HSP患儿血清sCTLA-4水平为(3670.9 ± 126.9) pg/ml，两者之间差异无统计学意义(P > 0.05)。与对照组比较sCTLA-4水均明显降低。
3.5. HSP患儿血清sCTLA-4水平与血清免疫球蛋白水平相关性分析
对HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平与血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM和IgE)水平进行相关性分析，结果显示期间均无明显相关性(r = −0.172~0.187，P均 > 0.05)。
4. 讨论
过敏性紫癜发病机制复杂，其可能与感染、遗传、药物等因素的刺激诱发所致的体液免疫、细胞免疫功能异常，细胞因子及炎症介质的参与有关。其中，IgA免疫复合物在HSP发病中可能起着关键的作用 [8]。众多研究证实，HSP患者存在T淋巴细胞亚群异常及免疫功能紊乱 [9] [10]。
CTLA-4属B7分子家族，是淋巴细胞表面的一种转导负性免疫信号的配体蛋白分子 [11]。它与CD28分子结构具有70%的同源性，两者结合相同的配体B7。它表达于活化的T淋巴细胞表面，在静止的T淋巴细胞上表达很弱。CD28/CTLA-4竞争性结合B7，组成了一个具有正、负向调节T细胞的系统，通过CTLA-4和CD28在时间和空间上的差异表达，保证正、负信号共同参与免疫过程。而sCTLA-4是CTLA-4的可溶形式，通过干扰共刺激通路，抑制T细胞的活化。已有研究显示，sCTLA-4在某些自身免疫性疾病中水平有所增高 [12]。国内外许多研究证实，CTLA-4涉及的免疫性疾病众多。CTLA-4在儿童过敏性哮喘 [13]、系统性红斑狼疮、川崎病 [14]、炎症性肠病 [15] 等多种自身免疫性疾病的发病过程中均有参与。CTLA-4存在多位点的基因多态性，其多态性可影响CTLA-4的功能及分子表达，导致自身免疫性疾病。已有文献报道 [16]，CTLA-4基因多态性与多种免疫相关性疾病有关联性。张蓉等 [17] 发现类风湿关节炎患者的外周血CD4+CD25+调节性T细胞表面的CTLA-4的表达水平低于正常人，说明CTLA-4的低表达导致T细胞功能异常，从而参与了类风湿关节炎的发病。白冷媚等 [18] 人研究发现，在SLE患者中，CTLA-4较健康组低表达，可能是由于CTLA-4为瞬时表达并快速进入细胞质，也不能排除其低表达是否与SLE患者CTLA-4分子下调功能的受损或与T细胞耗竭有关。Oaks等 [19] 发现自身免疫性甲状腺疾病患者血清sCTLA-4水平升高，郑维红等 [20] 研究发现重症肌无力患者血清sCTLA-4水平明显高于对照组，其病理意义尚有争议。因其可与细胞膜CTLA-4和CD28同时竞争性与APCs表面B7结合，发挥负性免疫调控作用抑或阻止对T细胞反应的下调，有待进一步探讨。
有关HSP患者血清sCTLA-4水平变化情况，国内外报道未见。侯红红等 [21] [22] 曾对CTLA-4基因多态性与过敏性紫癜的相关性进行研究。证实了-1722位点CC基因型及C等位基因在病例组和对照组之间无统计学意义，但可增加HSP发生肾脏损害的风险。而CTLA-4(AT)n基因重复次数为16时可能为HSP发病的易感基因，重复次数为15时则可能为女性HSP患儿发病的易感基因。Soylemezoglu等对土耳其100名HSP患者的研究认为，+49位点基因多态性与HSP及HSPN均无相关性，但CTLA-4AG基因型和HLA-DRB1的存在可能是这些患者发生肾损害的危险因素 [23]。本研究采用双抗体夹心ELISA方法检测了49例HSP患儿急性期血清中sCTLA-4的水平，发现HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平均明显低于健康患儿对照组，有/无前驱感染组间血清sCTLA-4水平无显著性差异，提示HSP患儿急性期T细胞CTLA-4表达降低，对免疫应答的负性调控作用低下，在HSP的发病机制中可能扮演重要角色。T细胞的活化需要两种信号的参与。第一信号即为TCR与抗原肽-MHCII分子复合物的特异性结合，此信号对T细胞活化是必需的；第二信号也被称为共刺激信号，包括CD28/CTLA-4-B7等，他们组成了一个具有正、负向调节T细胞的系统，通过CTLA-4和CD28 在时间和空间上的差异表达，保证正、负信号共同参与免疫过程。CTLA-4与B7结合后，则可抑制T细胞的增殖和活化，是细胞周期停滞在G0/G1期，不向S期发展 [24]。同时，CTLA-4可促进T细胞分泌TGF-ß，减少IL-2等细胞因子的分泌，从而负性调控T细胞的应答。同时，CTLA-4/B7相互作用可减低IL-4的产生，抑制CD4+T细胞向Th2发育。Oosterwegel等发现，CTLA-4被封闭或缺乏将导致CD4+T细胞向Th2亚群分化 [25]。由此可见，CTLA-4作为负调节因子，在T细胞反应的起始和终止过程中起着重要的作用。然而，本研究资料显示HSP患儿急性期血清sCTLA-4水平与血清免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM和IgE)之间均无明显相关性。同时发现有、无早期肾损害HSP患儿间急性期血清CTLA-4水平并无显著性差异，提示sCTLA-4水平变化在HSP与紫癜性肾炎发病机制中的地位需要进一步探讨。
NOTES
*通讯作者。