1. 引言
食管癌是最具侵袭性的癌症之一,是世界范围内癌症致死的第六大原因。全球大约70%的食管癌发生在中国。目前,食管癌的早期诊断和治疗方法有限,导致患者五年生存率只有10% [1] 。
MARCH2 (Membrane-associated RING-CH protein 2)是MARCH家族成员之一(MARCH1-11),含有RING结构域、两个跨膜区和PDZ结构域 [2] 。MARCH2最初被认为是与病毒免疫逃逸蛋白相关的泛素连接酶家族成员之一 [2] 。功能性研究显示MARCH2能减低细胞表面受体如转铁蛋白受体和共刺激分子B7.2 [2] 。Nakamura研究团队发现MARCH2可以直接特异性结合STX6,参与内体到高尔基体的运输 [3] 。Guggino的研究显示MARCH2可以结合CAL和STX6,促进CFTR的泛素化和降解 [4] 。Shenoy报道MARCH2与β2AR相互结合可以促进β2AR的泛素化,调节β2AR在细胞表面的水平 [5] 。近来,Xavier课题组证实MARCH2通过PDZ膜序与DLG1相互作用,促进DLG1泛素化并减低DLG1在细胞链接处的表达水平,干扰细胞的极性 [6] 。另有报道称DLG1在人类肿瘤中发挥重要作用 [7] 。
DLG1 (Human Discs large tumour suppressor)是膜相关的鸟苷酸激酶家族一员,包含多个PDZ结构域(PSD, DLG1, ZO-1),每个PDZ由90个氨基酸左右组成,能够通过特异性识别配体蛋白C末端的氨基酸残基介导蛋白质之间的相互作用,属于分子脚手架蛋白。DLG1是Scribble极性复合体的一个组成部分,参与调节细胞极性和增殖,在上皮组织和细胞生长调控之间发挥重要的连接作用 [8] [9] 。有文献报道,在几种不同类型肿瘤中,DLG1的表达缺失与恶性进展的晚期时细胞极性和组织架构的完全缺失密切相关,因此定义DLG1为潜在的肿瘤抑制因子 [10] [11] 。此外,DLG1在人类发挥肿瘤抑制活性的最令人信服的依据是DLG1被鉴定为几种病毒癌基因蛋白的靶标,如人乳头状瘤病毒(HPV) E6,人T细胞白血病病毒类型1Tax和腺病毒类型9 E4-ORF1 [12] 。然而,近来的研究显示DLG1在一些特异的环境中可以获得癌基因属性,DLG1表达减低在人类肿瘤生成中发挥重要的作用 [9] 。
在本研究中,我们应用免疫组织化学染色的方法检测了50例食管癌组织中MARCH2和DLG1的表达情况,并对MARCH2和DLG1表达之间相关性以及二者与临床病理参数之间的相关性进行了分析。
2. 材料和方法
2.1. 临床食管癌标本
回顾性分析2004年3月~2014年10月在山东医学高等专科学校附属医院进行手术治疗的50例食管癌患者的临床资料,选取癌旁正常食管组织20例作为对照。所有患者均经2名病理医师确诊为食管癌。所选病例临床资料完整。该研究已获得相应的伦理许可。
2.2. 试剂及抗体
多克隆兔抗人MARCH2抗体购自美国Abcam公司;多克隆兔抗人DLG1抗体购自美国Abclonal公司,免疫组织化学染色试剂盒购自北京中杉金桥公司。
2.3. 检测方法
应用免疫组化SP法进行指标检测。所有采集的标本均制成蜡块,连续切片,厚4μm,脱蜡、水化,3%过氧化氢甲醇溶液去除内源性过氧化物酶,PBS缓冲液冲洗,EDTA (pH = 9.0)高压热修复,滴入1:100稀释的一抗MARCH2或1:100稀释的一抗DLG1,4℃过夜,滴入二抗,室温1小时,DAB显色。用已知MARCH2和DLG1阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。
2.4. 结果评估
每张切片随机选取有代表意义的5个高倍视野,每高倍视野需计数200个细胞,应用IRS免疫反应评分(immunoreactivity score) [13] ,把着色细胞数的比例和着色的强度结合起来。① 按着色细胞占计数细胞百分比计分:0分(阴性),1分(<10%),2分(11%~50%),3分(51%~80%),4分(>80%)。② 按着色的强度计分:0分(无着色),1分(淡黄色),2分(黄色),3分(棕黄色)。总分 = ① × ②:0分(阴性,−);1~3分(弱阳性,+);4~7分(中等阳性,++);8~12分(强阳性,+++)。
2.5. 统计学分析
应用SPSS 20.0软件进行统计学分析,组间比较采用χ2检验,两变量间的相关性采用Spearman等级相关性分析,P < 0.05的差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. MARCH2和DLG1的检测结果
MARCH2呈弥漫的棕色细颗粒状表达,染色主要位于肿瘤细胞的细胞质,部分位于细胞核(图1 A)。MARCH2在50例食管癌组织中,呈现阴性表达的有8例,呈现弱阳性表达的有9例,呈现中度阳性表达的有21例,呈现强阳性表达的有12例。MARCH2在食管癌组织中的阳性表达率为84% (42/50)。在20例非肿瘤食管组织中,有15例呈现阴性表达,5例呈现弱阳性表达。MARCH2在非肿瘤食管组织中阳性表达率为25% (5/20)。MARCH2在食管癌组织中的阳性表达率84% (42/50)明显高于非肿瘤食管组织6.7% (2/30),其差异有统计学意义(P < 0.01,表1,图1 A)。
DLG1染色主要位于肿瘤细胞的细胞质和(或)细胞膜(图1 B)。在50例食管癌组织中,DLG1的阳性表达率为18% (9/50)。在20例非肿瘤食管组织中,有3例为阴性表达,3例为弱阳性表达,10例呈现中度阳性表达,4例呈现强阳性表达。DLG1在非肿瘤食管组织中阳性表达率为85.0% (17/20)。DLG1在食管癌组织中的阳性表达率18% (9/50)明显低于非肿瘤食管组织85% (17/20),差异具有统计学意义(P < 0.01,表1,图1 B)。
Table 1. Expression of MARCH2 and DLG1 in esophagus carcinomas and non-tumor esophagus tissues
表1. MARCH2和DLG1在食管癌及非肿瘤食管组织中的表达
Figure 1. Immunohistochemical staining for MARCH2 and DLG1 in human esophagus cancer tissues. (A) Positive expression of MARCH2 was detected by immunohistochemical staining (SP, ×400); (B) Positive expression of DLG1 was detected by immunohistochemical staining (SP, ×400)
图1. MARCH2和DLG1在食管癌组织中的免疫组织化学染色;(A) MARCH2在食管癌组织中的阳性表达(SP, ×400);(B) DLG1在食管癌组织中的阳性表达(SP, ×400)
3.2. MARCH2和DLG1的表达与患者临床病理特征的关系
根据免疫组织化学染色的IRS评分,我们分析了MARCH2和DLG1表达与食管癌患者的临床病理特征的关系。如表2所示,MARCH2的阳性表达与食管癌更大的肿瘤直径(P < 0.05)、更差的分化程度(P < 0.01)、更深的浸润深度(P < 0.01)、淋巴结转移(P < 0.05)和更高的TNM分期密切相关(P < 0.01)。MARCH2的阳性表达与年龄和性别没有明显的相关性。DLG1的阳性表达与食管癌患者的更差的分化程度(P < 0.05)、更深的浸润深度(P < 0.05)、淋巴结转移(P < 0.01)和更高的TNM分期(P < 0.01)密切相关。DLG1的阳性表达与性别、年龄和肿瘤大小没有明显的相关性。
Table 2. Association of MARCH2 and DLG1 staining with clinicopathological characteristics
表2. MARCH2和DLG1表达与食管癌临床病理特征的关系
3.3. MARCH2和DLG1之间的相关性
如表3所示,MARCH2表达与DLG1表达呈现显著的负相关(P < 0.001)。
Table 3. Correlation between MARCH2 and DLG1 in esophagus cancer tissues
表3. 食管癌组织中MARCH2和DLG1之间的相关性
4. 讨论
MARCH2是由N端RING结构域、跨膜区以及C端的PDZ结构域组成的二次跨膜蛋白 [2] 。Xavier科研团队证实MARCH2能够定位于HEK293T细胞的细胞膜 [6] 。作为E3泛素连接酶,MARCH2在细胞的连接处促进DLG1的泛素化和降解,干扰细胞极性。已有研究表明DLG1在人类肿瘤中发挥着非常重要的作用 [7] ,而MARCH2在肿瘤中的作用却鲜有报道。Suqihara [13] 研究小组报道细胞极性决定因素DLG1的缺失是子宫内膜癌淋巴结转移和不良预后的新分子标志物。DLG1位于正常子宫内膜组织的细胞膜。DLG1缺失常出现在较晚临床分期、高级别组织学分级、淋巴结转移、深部子宫肌层浸润和阴性雌激素/孕激素受体的患者。DLG1缺失的患者总生存率较低。体外实验表明在子宫内膜癌细胞中敲减DLG1导致肿瘤迁移和侵袭加速 [11] 。Daniela [14] 课题组报道DLG1极性蛋白表达与低级别宫颈上皮内瘤变的疾病进展相关。他们的数据表明DLG1染色样式与正常组织相似的低度病变患者更有可能倒退(n = 23, Pattern I),所有的弥漫的强DLG1染色的低度病变标本可能向高级别病变进展(n = 4, Pattern II)。最后,所有持久稳固的低度病变的分析显示未确定的DLG1染色(弥漫分布且无高强度的染色) (n = 3, Pattern III)。他们发现DLG1表达样式和病变的进展呈显著相关性。因而,我们提出一个假设,MARCH2有可能是通过DLG1来参与肿瘤的发生及进展。
在本研究中,我们用免疫组织化学染色的方法检测了食管癌组织中MARCH2和DLG1的表达情况,并且分析了二者之间的相关性以及与临床病理特征的相关性。我们发现MARCH2在食管癌组织中的表达比在非肿瘤食管组织显著升高,提示MARCH2可能参与了肿瘤的发生。尤其是,我们的结果显示MARCH2的阳性染色更多出现在肿瘤直径更大、不良分化、浸润更深、有淋巴结转移和更高TNM分期的肿瘤,提示MARCH2可能在肿瘤的进展中发挥作用。相反,食管癌组织中DLG1的表达比在非肿瘤食管组织中有明显降低,而且DLG1的表达缺失与不良分化、浸润更深、淋巴结转移和更高的TNM分期密切相关。此外,MARCH2表达与DLG1呈负性相关。这些结果提示MARCH2过表达和DLG1低表达参与了食管癌的发生及进展。MARCH2和DLG1的联合检测可能为食管癌的诊断、治疗和预后提供依据。
基金项目
本研究由国家自然科学基金项目(81702776);山东省高等学校科技计划项目(J17KA238);山东省医药卫生科技发展计划项目(2016WS0569)资助。