1. 引言
洋金花为茄科植物白花曼陀罗(Datura metel L)的干燥花，又名曼陀罗花、闹洋金等 [1] 。现代医学研究表明洋金花具有平喘止咳、解痉止痛等药用价值和功效 [2] ，在中医药学中被广泛使用。东莨菪碱(图1)是一种广泛存在于洋金花中的莨菪烷类生物碱，在抑制腺体分泌和镇静等方面有着良好的药用价值 [3] 。在临床上，其主要用于解痉、散瞳、抗晕动、抗震颤麻痹、防治帕金森症等疾病的治疗 [4] [5] 。
大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积。因其吸附性好、吸附迅速、解吸容易等优良特性，在分离纯化天然药物活性成分中受到广泛青睐 [6] 。在我们课题组前期工作中，付传香等 [7] 研究表明D151大孔吸附树脂对东莨菪碱具有较大的吸附率和洗脱率，对东莨菪碱的分离纯化效果较好。为了进一步提高东莨菪碱的纯度，以吸附率和洗脱率为评价指标，以安徽皖北地区种植的道地洋金花为原料，对工艺参数中的吸附液的pH、洗脱液的pH进行了进一步优化。
Figure 1. The chemical structures of scopolamine
图1. 东莨菪碱的化学结构式
2. 原料、材料及设备
主要原料：洋金花(来自安徽德信佳生物医药有限公司洋金花种植基地)。洗净后于60℃下在真空干燥箱中干燥6 h，用中药粉碎机粉碎并过60目筛备用。
主要试剂与材料：氨水、二氯甲烷等均为分析纯，乙腈、磷酸等均为色谱纯，购买于国药集团化学试剂有限公司。东莨菪碱标准品(纯度 > 98%)，由安徽德信佳生物医药有限公司提供。超纯水实验室自制。D151大孔吸附树脂购于安徽三星树脂科技有限公司。
主要仪器：中药粉碎机(ML-800，苏州摩菱机械设备有限公司)；高相液相色谱仪(Agilent1260，美国安捷伦公司)；超声波提取仪(SCQ-250B5，福州迈康自动化设备有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)；空气恒温摇床(HQ45Z，武汉中科科仪技术发展有限公司)。
3. 试验方法
3.1. 色谱条件
液相条件：流动相为乙腈-70 mmol/L磷酸钠溶液(含有17.5 mmol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH至6) (V/V, 1/2)，柱温25℃；检测波长216 nm；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；色谱柱：SGE protecol C18色谱柱(5 μm, 4.6 × 250 mm) [8] 。
3.2. 东莨菪碱标准曲线的绘制
精密称取20 mg东莨菪碱标准品，添加色谱级乙腈，在超声环境下将东莨菪碱标准品完全溶解后转移至5 mL容量瓶中，继续添加色谱级乙腈定容至刻度线，配制4 mg/mL标准贮备溶液，待用。然后用色谱级乙腈将标准贮备溶液依次等倍稀释成浓度为4，2，1，0.5，0.25 mg/mL。经0.45 μm的微孔滤膜处理后，依照上述色谱条件依次注入高效液相色谱仪，以峰面积值Y为纵坐标，以浓度值X为横坐标，绘制标准曲线。
3.3. 东莨菪碱粗提物的制备
100 g洋金花干粉→200 mL氨水进行润湿→超声波辅助二氯甲烷提取(1.0 L二氯甲烷，25℃，超声波功率为180 W，超声时间为30 min，重复提取两次 [9] )→提取液过滤，减压回收二氯甲烷，酸性水溶液复溶后用于树脂吸附实验。
3.4. D151树脂预处理
用95%乙醇浸泡树脂24 h，用超纯水洗至无醇，分别依次用5%的盐酸溶液和5%的氢氧化钠溶液处理树脂12 h，最后用超纯水冲洗至中性 [10] 。
3.5. D151树脂装柱层析
将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭活塞，向柱子中添加适量的超纯水。将大孔树脂水浆溶液一次性均匀倒入层析柱中，并不断添加超纯水。将过量水通过柱底放出，始终保持水面高于树脂层面3 cm左右，直到所有树脂全部转移至柱中。待树脂全部转移后，继续向柱子中添加去超纯水，持续时间为30 min [11] 。装柱完成后，取500 mL初始质量浓度为0.20 mg/mL的东莨菪碱提取液(pH为7.6)在25℃下上柱，流速为2 BV/h (100 mL/h)，用试管收集流出液，检测每管流出液中东莨菪碱的浓度，吸附平衡后，用超纯水冲洗柱子，然后在流速为2 BV/h时，用800 mL酸性水溶液(pH为1.2)进行洗脱，收集流出液进行高相液相色谱检测。
3.6. 分离纯化工艺的优化
3.6.1. 吸附液pH的优化
准确称取7份350 mg D151大孔树脂至100 mL带塞锥形瓶中，分别加入20 mL pH值为7、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2的质量浓度为0.20 mg/mL的东莨菪碱提取液，25℃下在空气恒温摇床中振荡24 h。
3.6.2. 洗脱液pH的优化
准确称取5份350 mg D151大孔树脂至100 mL带塞锥形瓶中，按照3.6.1节最优条件进行静态吸附实验。待吸附平衡结束后，先用超纯水冲洗树脂，然后分别用20 mL pH值为0.8、1、1.2、1.4、1.6的酸性水溶液于25℃下在空气恒温摇床中振荡洗脱24 h。
4. 实验结果
4.1. 东莨菪碱标准曲线
按照3.1节中的色谱条件，分别测定各个浓度下的标准品溶液，将所得数据分析处理，绘制出如图2所示的东莨菪碱标准曲线，其线性回归方程：Y = 12893X + 648.33，R2 = 0.9995。
由图2可知，东莨菪碱在0.25~4 mg/mL范围内具有良好的线性关系。
Figure 2. Standard curve of scopolamine
图2. 东莨菪碱标准曲线图
4.2. 吸附液pH的选择
东莨菪碱是一类具有羟基的化合物，故样液的pH对树脂吸附效果有一定的影响。前期课题组研究表明，吸附液的pH值在8左右时，D151树脂对东莨菪碱的吸附率较高，为了进一步优化吸附液的pH，保持其他条件不变，调节样液的pH进行动态吸附实验。由图3可知，在一定范围内，PH值低于7.6时，D151树脂对东莨菪碱的吸附率随着PH的降低而减少，当pH值大于7.6时，D151树脂对东莨菪碱的吸附率趋于稳定，这可能是东莨菪碱盐被还原为游离态达到平衡造成的。因此，吸附液pH为7.6最佳。
4.3. 洗脱液pH的选择
洗脱液的pH值是影响东莨菪碱洗脱率的一个重要因素。图4为洗脱液pH值对洗脱率的影响。从图中可以看出：当pH值大于1.2时，东莨菪碱的洗脱率呈显著下降趋势，pH值为0.8~1.2时，东莨菪碱的洗脱率趋于平稳。因此，洗脱液的pH值为1.2最佳。
4.4. 样品纯度分析
按照上述色谱条件，将D151树脂分离纯化后的东莨菪碱样品进行高相液相色谱分析。结果如图5所示，东莨菪碱的色谱峰保留时间为16.599 min，与标准品进行对比，为东莨菪碱的色谱峰。并且从图中可以看出，经过纯化后的东莨菪碱样品杂质较少。将峰面积代入标准曲线的公式，计算出样品中东莨菪碱的纯度为84.2%。
Figure 3. Effect of sample solution pH on adsorption efficiency
图3. 吸附液pH值对吸附率的影响
Figure 4. Effect of eluent pH on desorption efficiency
图4. 洗脱液pH值对洗脱率的影响
Figure 5. HPLC chromatogram of extract purified by D151 resin
图5. D151树脂分离纯化东莨菪碱后的高相液相色谱图
5. 结论
本文以D151树脂作为填料对东莨菪碱进行纯化，在原有工艺的基础上，进一步优化上样液(吸附液)的pH和洗脱液的pH对分离纯化工艺的影响，确定了较佳的工艺条件：上样溶液的pH为7.6，洗脱液的pH为1.2。在此分离纯化条件下，获得了纯度为84.2%的东莨菪碱样品。
基金项目
2016年安徽省科技重大专项项目(16030801111)。
NOTES
*通讯作者。