1. 引言
里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)在我国广泛存在，且有多达21种血清型 [1]。里默氏菌没有鞭毛和纤毛等附属结构，有报道包括外膜蛋白和外毒素等具有毒力贡献 [2] [3] [4]。胡青海等 [5] 在2013年揭示了RA生物膜形成的规律，且证明它也是里默氏菌的毒力因子，这引起了很多研究者的兴趣 [6]。细菌生物膜的主要成份是多糖物质 [7]，含水量高达90%以上，与染料的亲和力弱，塌陷或者皱缩产生形变 [8]，通常将菌体和背景分别着色，把不透明的生物膜衬托出来以便于观察，但普通显微镜观察生物膜效果不理想 [9]。另一种方法是负染法再行电子显微镜观察，由于细菌带负电荷 [7]，需要采用较强电子散射能力和易被生物吸附的试剂诸如钼酸铵、四氧化锇、磷钨酸等进行染色，经电子显微镜可以看到普通显微镜下无法看清楚的结构，但该方法需要制片、高锰酸钾氧化、水洗、草酸漂白、水洗、95%酒精分化、烘干、二甲苯固封等步骤，程序复杂，操作繁琐。本研究是在基底表面(玻璃或者硅片基底)进行化学改性处理，可以直接在基底表面固定RA，经适当条件优化可行SEM/TEM观察，具有耗时少、操作简单等优点。
2. 试剂和方法
2.1. 试剂
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)购买自上海远幕生物公司；戊二醛购买自山西益鑫泰生物科技有限公司；其它试剂均属分析纯，购买自重庆川东化工有限公司；里默氏杆菌(RA)为本实验室分离保存；磷钨酸染色SEM观察在陆军军医大学电镜中心完成；醛基化表面固定SEM观察在重庆科技学院大型仪器共享中心完成。
2.2. 方法
2.2.1. 细菌的分离和纯化参照文献 [10] 的方法执行。
“在无菌条件下将病死鸭脑组织接种于巧克力营养琼脂平板，置蜡烛缸中37℃培养24 h，可疑菌落用巧克力琼脂平板纯化及扩大培养 [3]。”
2.2.2. 常规染色光学显微镜观察
细菌的生物膜观察经常性使用干墨水负染法染色，其程序为①加一滴60 g/l葡萄糖液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一环墨水，充分混匀；②另取一端边缘光滑的载玻片作推片，将一端边缘置于混合液前方，然后稍向后拉，当片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿片接触的后缘散开，尔后以大约30˚角迅速将混合液推向玻片另一端，使混合液铺成薄层；③空气中自然干燥；④用甲醇浸没涂片固定1 min，弃去甲醇；⑤在酒精灯上方用文火干燥；⑥用甲基紫染1~2 min；⑦用自来水轻轻冲洗，自然干燥；⑧高倍镜或油镜检查。
2.2.3. 磷钨酸染色电子显微镜观察
样品制作程序为：①收集/离心菌体。②清洗菌体。③固定菌体。按常规方法脱水。2.5%戊二醛溶液固定2~4 h → 磷酸缓冲液清洗3次 → 1%锇酸4~6 h → 缓冲液清洗3次 → 乙醇梯度脱；④临界点干燥。⑤离子溅射金。⑥SEM观察。
2.2.4. 醛基化玻片固定电子显微镜观察
硅片在H2SO4/H2O2 (V/V = 3:1)中氧化30分钟，去离子水清洗3次，得到氧化硅片。在APTES/H2SO4 (V/V = 1:15)混合溶液中反应2小时，先用乙醇清洗3次，再用PBS清洗3次。硅片在戊二醛/PBS溶液中反应1.5小时后，先用PBS清洗，再用去离子水清洗3次，制成的玻片。然后稀释菌液，调整到1 × 105 CUF含量，滴加在玻片基底表面，自然阴干，放干燥箱烘干若干时间，制备好的样品经喷金处理直接观察。
3. 结果
3.1. 光学显微镜观察
从图1可见，常规染色RA图像只能呈现黑色的模糊背影，菌体呈现较好的形态，但细菌产生生物膜的时间和厚度很不一样，还要视具体的染色操作技术的熟练程度而论。因此，此种方法的效果并不能很好地观察到RA的生物膜结构。
Figure 1. Optical observation of RA dyed by conventional method. 1000× amplification
图1. RA常规染色光镜图1000×
3.2. 磷钨酸染色SEM观察
实验中我们将细菌严格按照既定操作程序处理。如图2所示，RA在SEM图像中显示无菌毛和鞭毛等附属结构，菌体经放大15,000倍，大小2~3 × 3~5 um。从图中我们可以看到图像的背景，而RA轮廓清晰可见，这是由于染液中某些电子密度高的物质包埋低电子密度的样品，但仍然不能很好地呈现生物膜结构。利用扫描电镜可以对细菌的附属结构，例如菌毛、鞭毛等清晰观察，但电子显微重依赖电子的穿透作用，而生物样品一般导电性能差，因此成像效果较差。
Figure 2. SEM observation of RA dyed by phosphato-tungstic acid.15000× amplification
图2. RA的常规染色SEM图像15000×
3.3. 醛基化硅片SEM观察
RA在戊二醛表面直接固定，在SEM图像中呈现清晰的图像(图3)。为了获得更清晰的图像，我们对RA进行了喷金处理，如图3a为常规染色法获得的SEM图像，而图3b为经过优化后获得的SEM图像，可以看出，在菌体外围出现一层明显的透明圈，应该归于RA生物膜结构由于干燥或者喷金发生与菌体龟裂的结果。喷金可以明显提高样品的导电性，增强图像对比度和清晰度。研究发现，喷金时间对成像结果很重要。金膜太厚会掩盖样品的表面细节，太薄样品的导电性差，都会影响观察结果。研究证明结果表明，喷金5~20秒可以得到满意的效果。细菌表面有蛋白质和糖基等结构固定，可以通过不同的连接方法进行固定。不同修饰方法对于蛋白质的固定能力也不同。
Figure 3. SEM observation of RA directly treated by gold-spray and tethered on silicon substrate 20,000× amplification
图3. 对RA喷金处理得到的SEM图像20,000×
经过优化，我们发现以60℃加热30分钟，喷金5秒会获得满意的效果。值得注意的是，喷金过渡会使RA菌体龟裂，产生质壁分裂。SEM观察时，高对比度使图像富有立体感，但是对比度太高也会损失一些细微的结构。我们还意外地捕捉到RA赘生物在菌体侧壁和顶端分别出芽生长的情况，这为揭开RA分裂方式提供了有益的佐证。如图4所示，在RA的侧面和顶部分别捕捉到附着的赘生物。
4. 讨论
由于细菌菌体本身的生物属性及蛋白质、脂肪、糖等化学本质，以及荚膜并不依赖微生物的严格养分，即使添加更多的糖分对RA大罐发酵得到的菌体也是如此，细胞壁与细胞内容物之间并不能很好地进行区分，更不能把荚膜结构与细胞膜严格区分开来 [11]。荚膜主要与细菌的毒力与黏附性能等有关，胡青海等认为生物膜可能跟基因有关 [12]。因此，即使采用常规的经典的染色处理RA再行高分辨的SEM观察，也不能很好地观察到RA的荚膜结构。用磷钨酸染色，由于染色液的溶剂、离子组成、亲水性、
Figure 4. SEM of RA’s neoplasm tethered (a) on the side and (b) on the top (arrow noted)
图4. RA赘生物的SEM图像(a)侧面附着，(b)顶端附着
PH值等变化都有可能引起有缺陷的SEM图像。样品的亲水性也是容易引起负染色缺陷重要原因，当亲水性好的时候，负染色结果经常显示背景差，且样品浓度得不到真实显示。我们采用直接在醛基化硅片表面固定RA，经适当的加热和喷金处理，可以获得较清晰的RA菌体及其荚膜等附属结构的SEM图像。韦强等 [13] 2005年提取了RAⅡ赘生物，并得到有关RA赘生物的SEM图像。研究还获得了RA赘生物从不同的菌体部位释放SEM图像，这为揭开RA赘生物的毒力贡献具有方法学价值。
5. 结论
硅片表面经醛基化处理可以共价固定里默氏杆菌，在60℃烘干30分钟喷金5秒，可以直接用SEM观察到表面的生物膜结构，与常规染色与磷钨酸染色比较具有图像更清晰，耗时短，容易操作等特点，可以为RA研究提供新的方法学。
基金项目
研究得到重庆市科委民生项目(cstc2016shmszx0600)和工业发酵微生物重庆市重点实验室开放基金资助(LIFM201712)，以及重庆市教委科技项目KJZD-K201806401和KJ1605701与KJ1505901资助。