黑果枸杞与枸杞子水提取液清除羟自由基及抗脂质过氧化活性比较研究

Comparative Study the Scavenging Hydroxyl Free Radical and Anti-Lipidperoxidation Activity of Water Extract between Lycium ruthenicum and Lycium barbarum Fruits

摘要: 目的：对黑果枸杞和枸杞子水提取液的清除羟自由基及抗亚油酸脂质过氧化活性进行比较研究。方法：采用Fenton-水杨酸法及亚油酸-硫氰酸铁法，分别测定黑果枸杞和枸杞子水提取液的清除羟自由基和抗脂质抗氧化能力。结果：黑果枸杞水提取液清除羟自由基及抗亚油酸脂质过氧化能力IC₅₀值分别为1.718 mg∙ml⁻¹、0.112 mg∙ml⁻¹ (枸杞子水提取液分别为及1.298 mg∙ml⁻¹、0.058 mg∙ml⁻¹)。结论：枸杞子水提液清除羟自由基及抗脂质过氧化活性均强于黑果枸杞水提取液，二者均具有明显的体外清除自由基抗氧化活性及开发天然抗氧化剂的潜力。

Abstract: Objective: To compare antioxidant activity of water extract between Lycium ruthenicum Murr. and Lycium barbarum L. Methods: The scavenging hydroxyl radical and anti-lipidperoxidation capacity of water extract of Lycium ruthenicum Murr. and Lycium barbarum L. were evaluated by the Fen-ton-salicylic acid method and Linoleic acid-ferric thiocyanate assay. Results: The IC₅₀ value of Lycium ruthenicum Murr. with hydroxyl free radical scavenging capacity and anti-lipidperoxidation ability was 1.7176 mg∙ml⁻¹ and 0.112 mg∙ml⁻¹, respectively (Lycium barbarum L. 1.2977 mg∙ml⁻¹, 0.058 mg∙ml⁻¹, respectively). Conclusion: The results suggest that Lycium ruthenicum fruit and Lycium barbarum fruit show remarkably high antioxidant activity in vitro and are natural antioxidant development potential.

1. 引言

黑果枸杞为药食兼用的植物果实，为茄科Lycium ruthenicum Murr.的干燥成熟果实，含黄酮、多糖类成分 [1] ，有如下药理活性：抗氧化损伤 [1] - [6] 、抑制炎症 [7] 、抑制动脉硬化 [8] 、减轻肝脏损伤 [9] 、降低疲劳感 [10] 等。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，为历版中国药典收载药材 [11] ，化学成分与功效同黑果枸杞类似，具有如下活性：降低氧化损伤 [12] [13] [14] [15] 、抗大鼠溃疡性结肠炎 [16] 、抗辐射 [17] 、降血脂 [18] 、降低雷公藤毒性 [19] 、降低血压 [20] 等。李氏 [2] 等通过比较其黄酮含量、清除DPPH活性，发现黑果枸杞和枸杞子的黄酮含量和清除自由基活性略有差别。曾秀兰等 [21] 采用DPPH自由基清除法、铁离子还原法及螯合法，进行水提液抗氧化能力比较研究，发现其抗氧化作用存在差别。迄今为止，未见对二者水提取液清除羟自由基和抗亚油酸脂质过氧化活性进行比较研究的文献报道。本文采用Fenton-水杨酸法及亚油酸-硫氰酸铁法，分别测定黑果枸杞和枸杞子水提取液的清除羟自由基和抗脂质抗氧化能力，以期为黑果枸杞和枸杞子的开发提供深入实验依据。

2. 材料

2.1. 仪器

电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；紫外分光光度计(岛津公司)；电热炉(广州粤城电器厂)；超声波清洗器(布兰森超声公司)；水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)，移液枪(艾本德公司)。

2.2. 试药

硫酸亚铁(七水合物，AR，≥99.0%，Aladdin)，水杨酸(AR，98%，西安普莱特生物工程有限公司)，过氧化氢溶液(AR，30%，Aladdin)，亚油酸(AR，30%，Aladdin)，硫氰酸铵(AR，98%，Aladdin；黑果枸杞及枸杞子样品信息同文献 [21]。

3. 方法

3.1. 供试溶液的制备

1) 黑果枸杞水提液供试液:精密称取黑果枸杞粗末约100 mg，置具塞瓶中，加水20 mL，超声处理(水浴温度60℃) 45 min，过滤，即得。

2) 枸杞子水提液供试液:精密称取枸杞子粗末约100 mg，置具塞瓶中，加水20 mL，超声处理(水浴温度60℃) 45 min，过滤，即得。

3.2. 清除羟自由活性测定 [22]

1) 试剂制备

硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)：精确称取硫酸亚铁0.125 g于50 ml棕色量瓶中，用去离子水定容，摇匀，低温避光保存。

0.3%双氧水：取3%的双氧水2.5 ml于25 ml量瓶中，用去离子水定容，摇匀，低温避光保存。

水杨酸乙醇溶液(9 mmol/L)：精确称取水杨酸0.031 g于25 ml棕色量瓶中，去离子水定容后，摇匀，低温保存。

2) 羟自由基清除活性测定 精密吸取“2.1”制备的水提液0.1 ml，0.2 ml，0.3 ml，0.4 ml，0.5 ml，分别置具塞试管中，分别加入9 mmol/L水杨酸乙醇溶液0.5 ml，9 mmol/L硫酸亚铁溶液及0.3%双氧水溶液各0.2 ml，分别补加水至4 ml，摇匀，置避光处15分钟，于510 nm波长处测定，重复6次。按下式计算清除率。

$羟自由基清除率\left(\%\right)=\left[1-\left(A_1-A_2\right)/A_0\right]\times 100\%$

式中:A₁ = 样品溶液加入相应试液的吸光度值，A₂ = 样品溶液未加试液的吸光度值，A₀ = 以水代替样品溶液加入相应试液的吸光度值。

3.3. 亚油酸-硫氰酸铁法测定抗脂质过氧化活性 [23] [24] [25]

1) 试剂制备

硫酸亚铁溶液(20 mmol/L)：精密称取硫酸亚铁0.2780 g，置50 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

亚油酸溶液(5 mg/mL)：精密称取0.25 g亚油酸(Lot#D1515020)，置50 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

硫氰酸铵溶液(30%)：称取15 g硫氰酸铵，置50 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度摇匀，即得。

2) 抑制脂质过氧化活性测定 精密吸取“2.1”制备的水提液0.1 ml，0.2 ml，0.3 ml，0.4 ml，0.5 ml，分别置具塞试管中，分别加入亚油酸乙醇溶液0.1 ml，20 mmol/L硫酸亚铁溶液及30%硫氰酸铵溶液各0.04 ml，分别补加水至5 ml，摇匀，密闭避光放置10分钟，于475 nm波长处测定吸光度，每份样品平行操作6次。按下式计算过氧化脂质清除率。

$脂质过氧化抑制率\left(\%\right)=\left[1-\left(A_1-A_2\right)/A_0\right]\times 100\%$

式中:A₁ = 样品溶液加入相应试液的吸光度，A₂ = 样品溶液未加试液的吸光度，A₀ = 以水代替样品溶液加入相应试液的吸光度。

3.4. 数据分析

数据以 $\bar{x}\pm s$ 表示，组间比较以SPSS 13.0软件的单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

4. 结果

4.1. 清除羟自由活性比较

采用Fenton-水杨酸法测试黑果枸杞和枸杞子水提取液的羟自由基清除活性，测试结果以Excel 2010计算IC₅₀值，结果显示，黑果枸杞和枸杞子水提液的IC₅₀值分别为1.7176 mg∙ml⁻¹及1.2977 mg∙ml⁻¹，表明黑果枸杞水提液对羟自由基清除能力略低于枸杞子水提取液(详见表1)。

4.2. 抗脂质过氧化能力的比较

采用亚油酸-硫氰酸铁法测试黑果枸杞和枸杞子水提取液抑制脂质过氧化活性，测试结果以Excel 2010计算IC₅₀值，结果显示，黑果枸杞水提液及枸杞子水提液的IC₅₀值分别为0.112 mg∙ml⁻¹及0.058 mg∙ml⁻¹，表明黑果枸杞水提液对羟自由基清除能力略低于枸杞子水提取液(详见表1)。

Table 1. Hydroxyl radical scavenging and anti-lipidperoxidant effect of Lycium ruthenicum and Lycium barbarum ( x ¯ ± s , n = 6)

表1. 黑果枸杞和枸杞子羟自由基及抗脂质过氧化活性测试结果( $\bar{x}\pm s$ , n = 6)

^*表示组间P < 0.05。

5. 讨论

黑果枸杞即黑枸杞，《四部医典》等经典著作记载其能治心热病、月经不调等。民间作滋补强壮药 [1]。枸杞子为我国传统民贵中药材，同时又是国家卫生部公布的药食同源品种之一，在我国已有2000多年的使用历史。目前药品或保健食品羟基自由基清除能力或抗脂质过氧化能力暂无国家标准，本文仅对黑果枸杞与枸杞子的羟自由基清除能力和抗脂质过氧化能力作一比较，以为日后更深入的研究提供参考。

羟自由基对主要的几种生物分子如蛋白质、DNA和脂质都具有很强的破坏能力 [15] [22]。白细胞毒素(leukotoxin)、白细胞毒素二醇(leukotoxin diol)及羟基十八碳二烯酸(hydroxyoctadecaenoic acids)是亚油酸的氧化产物，研究表明，三者均具有细胞毒性，与哺乳动物多种疾病相关，而外源性的摄入也可以引起哺乳动物内分泌紊乱 [26]。本研究表明，黑果枸杞水提液清除羟自由基能力略弱于枸杞子水提取液，没有统计学意义，而枸杞子水提液的抗亚油酸脂质过氧化能力明显比黑果枸杞水提液强，二者有统计学意义(P < 0.05)。

基金项目

广州市科技计划项目(2016A040402033)；广州市产学研协同创新重大专项(201704030087)。