1. 引言
当今在化妆品行业常用的防腐剂几乎是小分子防腐剂，其缺点是极易渗透进皮肤，对人体肌肤造成危害。然而，具有良好生物相容性和抗/抑菌性能的大分子，因为其难渗透特征，有望发展成为一类低刺激的新型防腐剂，实现化妆品“绿色”化而被广泛关注 [1] [2] 。壳聚糖(Chitosan, CTS)是甲壳素脱乙酰基后的产物，是一种带正电荷的线型多糖，也是一种含游离氨基的碱性多糖，是一种优良的天然抗菌剂 [2] [3] [4] ，还可通过形成配位键与金属阳离子结合，应用于吸附分离。但由于壳聚糖分子链比较规整，容易形成结晶区，导致溶解性很差，只能溶于某些酸性的介质中，如稀醋酸、稀盐酸等，极大限制其应用范围。利用壳聚糖大分子中大量的羟基和氨基易于被修饰特性，如通过酰化、羧基化、烷基化、硫酸酯化、醛亚氨基化、叠氮化接枝等反应及共聚改性，可改性壳聚糖以满足实际应用需求 [5] [6] [7] [8] [9] ；纳米银是一种新兴的功能材料，由于其抗菌性的高效、广谱及不易产生耐药性等特征，可广泛应用于日常洗消领域。有研究表明：由于立方纳米银与球形纳米银与菌体的接触面积较大，所以一般立方或球形纳米银主要应用抗/抑菌方面，但是关于改性壳聚糖与纳米银的抗/抑菌协同效应鲜有报道 [10] [11] [12] 。
本实验采用自由基接枝共聚法制备水溶性良好的N-乙烯基吡咯烷酮接枝共聚改性壳聚糖(CTS-g-PVP)，后经原位法合成改性壳聚糖基纳米银复合材料(Nano-Ag@CTS-g-PVP)，并探究该复合材料的生物安全性、抗/抑菌性能及其协同效应。
2. 合成与表征
2.1. 主要试剂
CTS、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、Ce(SO4)2·4H2O、维生素C(Vc)，AgNO3、KBr、NaCl、浓硝酸、乙酸、丙酮(均为分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)；营养琼脂、马铃薯葡萄琼脂、LB肉汤食品级(广东环凯微生物科技有限公司)；革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、白色念珠菌(由广东药科大学食品学院微生物实验室提供)。
2.2. CTS-g-PVP、Nano-Ag@CTS-g-PVP的合成
参考文献方法 [1] [13] ，将2 g壳聚糖加入80 ml的去离子水，再加入1 ml的冰醋酸在45℃水浴且通氩气保护下，搅拌40 min，确保壳聚糖全溶后，加入64 mlN-乙烯基吡咯烷酮(NVP)以及硫酸高铈溶液(0.28 g硫酸高铈与0.8 ml浓硝酸和40 ml的去离子水混合搅拌溶解)。氩气保护下反应4 h。把反应液用丙酮沉淀后溶解透析冷冻干燥备用。
用冻干的CTS-g-PVP配成0.75%wt水溶液备用。配成0.04 mol/L的硝酸银溶液与0.02 mol/L的Vc溶液备用。在搅拌的条件下，往10 ml的0.75%wt CTS-g-PVP水溶液中缓慢滴加0.4 ml的0.04 mol/L的硝酸银溶液。搅拌20 min后，再往其中缓慢滴加0.8 ml的0.02 mol/L的Vc溶液。反应1 h，溶液颜色稳定，便可用丙酮沉淀后冷冻干燥备用。
2.3. 材料测试与表征
采用的主要仪器有：傅里叶变换红外光谱仪(Perkin-Elmer240Q，美国PE)、紫外可见分光光度计(U-3900，日本日立)、透射电子显微镜(JEM2010-HR，日本电子)。X-射线衍射仪(D8 ADVANCE，德国Bruker)、DSC差示扫描量热仪(Q2000，美国TA)。将CTS-g-PVP和Nano-Ag@CTS-g-PVP等分别进行FT-IR、UV-vis、TEM、XRD、DSC等表征。
2.4. 壳聚糖衍生物以及其载银复合材料的抗/抑菌性能评价实验
本实验采用K-B法探究 [12] [13] ，选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌三种受试菌株，首先分别探究CTS-g-PVP浓度及梯度载银量Nano-Ag@CTS-g-PVP的抗/抑菌效果；其次探究了Nano-Ag@CTS-g-PVP与CTS-g-PVP-cys或Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys复配后的抗/抑菌效果。具体实验方案是：1号样品含0.75%(wt)的Nano-Ag@CTS-g-PVP水溶液；2号样品为含1.5%(wt)的CTS-g-PVP-cys水溶液；3号样品为含0.75%(wt)的Nano-Ag@CTS-g-PVP跟1.5%(wt)的CTS-g-PVP-cys复配溶液；4号样品为含1.5%(wt)的Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys；5号样品为含0.75%(wt)的Nano-Ag@CTS-g-PVP跟1.5%(wt)的Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys复配溶液；选用市面上常用抗真菌药物，如氟康唑氯化钠注射、盐酸特比萘芬，分别加到0.75%(wt) CTS-g-PVP水溶液中得阳性对照组1和对照组2；Nano-Ag@CTS-g-PVP体系中的递度载银量为0%(wt)、0.76%(wt)、1.51%(wt)、2.25%(wt)。
2.5. 鸡胚尿囊膜实验
阴性对照样品为0.9%wt氯化钠溶液，受试物对应于抗/抑菌实验2.6中的1、3、5号样品，参照文献 [14] 方法进行鸡胚尿囊膜实验，考虑本实验的三种样品均为不透明液体，所以采用终点评判法，评判标准参照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》。
3. 结果与分析成
3.1. Nano-Ag@CTS-g-PVP红外光谱分析
如图1，3500~3000 cm−1处为CTS中羟基缔合峰，当壳聚糖改性为CTS-g-PVP，其中对应的这部分缔合峰明显变窄。1647 cm−1处强吸收峰为酰胺基的C=O伸缩振动峰，1397 cm−1和1087 cm−1处对应为PVP中的C-N伸缩和弯曲振动峰，据此可推测CTS成功接枝上了PVP支链。与CTS-g-PVP对比，Nano-Ag@CTS-g-PVP谱图中伯氨的弯曲振动峰由1521 cm−1迁移至1529 cm−1，这可说明在复合材料中
Figure 1. FT-IR spectra of CTS-g-PVP and its composite materials
图1. CTS-g-PVP及其复合材料的FT-IR图
纳米银与CTS中的-NH2存在螯合或配位。
3.2. Nano-Ag@CTS-g-PVP紫外–可见光光谱分析
据文献 [15] [16] 报道，450 nm附近的吸收峰对应准球形纳米银颗粒，最大吸收峰法波长与纳米银的平均粒径成正比，且纳米粒子分布越窄，其峰型越对称，强度越高。从图2(C)可知：对比光催化还原法与化学还原法的探究中发现，光催化还原法反应效率低且形成的纳米银粒径不均一；而化学还原法合成Nano-Ag@CTS-PVP复合材料探究实验中，该方法最佳Vc比硝酸银的加入摩尔比是1:1 (如图2(E))，且分散介质中含CTS-g-PVP浓度最好控制在0.75%~1.00%之间，形成的球形纳米银银尺寸是相对小且均一(如图2(F))。
3.3. Nano-Ag@CTS-g-PVP中纳米银的形貌
在0.75%(wt)的CTS-g-PVP水溶液体系中，原位法可制备储存稳定，分散均匀的改性壳聚糖基纳米银复合物，当载银量约1.51% wt (如图3(b))时，样品中纳米银尺寸大小相对均一，且纳米银的平均直径约为20~30 nm。这是主要是由于在原位反应体系中，改性壳聚糖分子上的伯氨基和银离子之间存在配位或螯合作用，对银颗粒起到了很好的分散稳定作用。若聚合物过多(如图3(c))，纳米银表面包裹严重，对复合材料的抗/抑菌性能影响明显；若聚合物过少(如图3(a))，纳米银颗粒并集严重，会导致复合材料稳定性明显降低。
3.4. DSC曲线分析
如图4，在90℃~120℃之间，CTS、CTS-g-PVP、Nano-Ag@CTS-g-PVP都有一个峰型差不多的吸热峰，分别对应在110℃、98℃、120℃，此峰应为聚合物中结晶水的汽化吸热峰。CTS在309℃有一个氧化放热峰，接枝共聚后改变了共聚物的聚集态，导致CTS-g-PVP的氧化放热峰左移至235℃。Nano-Ag@CTS-g-PVP的氧化放热峰在233℃，这可能是因为纳米银具有低温催化氧化的作用所致，对比两个样品的峰型，差异不明显，与CTS-g-PVP样品比较，Nano-Ag@CTS-g-PVP的氧化放热峰相对更强。
3.5. Nano-Ag@CTS-g-PVP的XRD表征分析
如图4，2θ = 35˚~80˚范围内分别有38.11˚、44.30˚、64.44˚、77.40˚四个衍射峰，与银的标准卡片完全吻合 [16] ，且分别对应于金属银的(111)、(200)、(220)、(311)四个晶面的衍峰，银立方体表面主要覆盖(100)
Figure 2. UV-Vis spectra of the series composite materials (Nano-Ag@CTS-g-PVP)
图2. 系列复合材料(Nano-Ag@CTS-g-PVP)的紫外光谱
Figure 3. TEM image of nano-silver particles in composite materials
图3. 复合材料中纳米银颗粒的TEM
晶面，准球形颗粒表面主要覆盖(111)晶面。根据XRD图可知，3号样品主要为基于CTS-g-PVP的准球形银纳米复合材料。
3.6. 抗/抑菌实验的形貌
3.6.1. 不同载银量的Nano-Ag@CTS-g-PVP抗/抑菌实验结果的形貌
如表1，在0.75% CTS-g-PVP水溶液中，合成梯度载银量的Nano-Ag@CTS-g-PVP复合材料，其抗/
Figure 4. The spectra of CTS-g-PVP and its composite materials (left for DSC spectra) (right for XRD spectra)
图4. CTS-g-PVP及其复合材料的DSC(左)、XRD(右)图谱
Table 1. Anti/bacteriostasis effect of Nano-Ag@CTS g-PVP with different nano-silver loaded
表1. Nano-Ag@CTS-g-PVP复合材料中不同载银量抗/抑菌效果
抑菌效果与其载银量存在一定关系。其中，对白色念珠菌的抗/抑菌效果，随纳米银的含量的升高明显增强；对金黄色葡萄球菌的抗/抑菌效果也有一定的增强趋势，但抗/抑菌强度远不及对白色念珠菌的抑制效果；对大肠杆菌而言，复合材料中的载银量对其抗/抑菌效果影响不明显。
3.6.2. 含Nano-Ag@CTS-g-PVP的复配体系抗/抑菌结果
如表2，对于三种实验珠菌而言，3号、4号、5号样品的抗/抑菌效果均明显阳性对照组，数据表明采用本实验方案，不论将Nano-Ag@CTS-g-PVP跟CTS-g-PVP-cys复配，或是跟Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys复配，都呈现出抗/抑菌性的协同效应。对比3号与5号样品实验数据，可推断纳米银颗粒是复合体系抗/抑菌性关键因素，这类效应对金黄色葡萄球菌理明显。对比表1和表2可知，当复合材料中含半胱氨酸改性基团，对大肠杆菌的抗/抑菌性有明显改善。但是，复合材料Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys的水溶性较Nano-Ag@CTS-g-PVP更差。因此，3号样品具有理想抗/抑菌性的复配体系。
3.7. Nano-Ag@CTS-g-PVP及其复配体系的鸡胚尿囊膜评价结果的形貌
如表3和图5所示：1号、3号和5号样品三种受试物均无眼刺激性，据此推测：Nano-Ag@CTS-g-PVP、CTS-g-PVP-cys和Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys三种材料的刺激性都极低，具有良好的生物相容性，且其对应的复配体系也亦是如此，因此在化妆品行业具有巨大的应用前景。
4. 结论
当模版剂改性壳聚糖CTS-g-PVP浓度为0.75%wt时，原位法制备载银量1.51%wt的Nano-Ag@CTS-g-PVP复合材料，其中准球形纳米银颗粒尺寸均一，粒径在20~30 nm范围，其对应的抗/抑菌性和生物相容性实验结
Table 2. Anti/bacteriostasis effect of nano-Ag@CTS-g-PVP and its compounding systems
表2. Nano-Ag@CTS-g-PVP及其相关复配的抗/抑菌效果
Table 3. Eye irritation score of CTS-g-PVP and its composite materials
表3. CTS-g-PVP及其载银复合材料眼刺激性评价
Figure 5. Image of the damage after three kinds of subjects acted on CAM
图5. 三种受试物作用CAM后受损现象照片
果主要有：
1) Nano-Ag@CTS-g-PVP(载银量1.51%wt)对白色念珠菌的抗/抑菌圈可达11.9 mm以上，因为抗/抑菌的协同效应，导致其效果优于市面上的抗真菌药物(氟康唑氯化钠注射液、盐酸特比萘芬)；
2) Nano-Ag@CTS-g-PVP与CTS-g-PVP-cys或者Nano-Ag@CTS-g-PVP-cys复配体系对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗/抑菌效果明显优于市面上的抗真菌药物。
3) 鸡胚尿囊膜实验表明CTS-g-PVP、Nano-Ag@CTS-g-PVP及其复配体系均无眼刺激性，有望成为一种新型化妆品防腐剂。
致谢
本研究工作获得了“中山火炬高技术创业中心有限公司创业孵化资金项目”资助。
NOTES
*通讯作者。