1. 引言
栘衣(Docynia indica (Wall.) Dcne.)是蔷薇科Rosacea苹果亚科Pomoideae栘衣属Docynia Dcne.的植物 [1] ,在我国西南少数民族地区及东南亚地区,常作为药食两用的植物资源,其茎叶、果实入药,具有消炎、接骨、舒经活血、舒肝止痛、清暑消毒等功效 [2] 。目前“栘衣”的利用主要局限于川滇少数民族地区,因其果实营养丰富主要作为野生水果食用,也有部分开发成果脯、果醋、果酒等,其嫩茎尖是傣族日常采集的野生蔬菜之一。栘衣全年生长,叶四季可采,因此极具开发潜力。
栘衣,常绿乔木,高5~10 m小枝粗壮,幼时有黄白色绒毛,渐脱落,红褐色或紫褐色。叶片披针形或卵状披针形,长5~8 cm,宽2~3 cm,顶端急尖或渐尖,基部阔楔形或近圆形,全缘或稍有浅钝锯齿,下面密生黄白色绒毛;叶柄长约1 cm,密生绒毛。花3~5朵丛生于小枝顶端;花梗短粗或近于无梗,果实伸长,密生绒毛;花白色,直径2.5~8 cm;萼筒钟状,外面密生黄白色绒毛;梨果较大,卵形或矩圆形,直径2~3 cm,萼裂片宿存;果柄较长 [1] 。其生长于野沟边、溪旁或灌丛中,是我国特有的民族药食两用植物之一,在西南地区多地均有分布;是西南民族地区一带常见的野生植物果实。因为其有着健胃消食和行气散淤的效果,当地人经常当山植来食用。目前,国内外对该植物的研究和报道很少。
栘衣是研究栘衣属系统发育不可缺少的珍贵材料。该种群分布区域相对较少,且野生资源在逐渐减少,需要着重加强保护。同时,因其具有市场开发价值,需要通过扩大种群数量来加强人工栽培繁殖与保护,故进行无性繁殖是唯一的途径。无性繁殖材料中多酚氧化酶(PPO)活性及总酚含量是影响成活的关键 [3] [4] [5] 。多酚氧化酶(PPO)活性和总酚含量的变化与植物生长时期密切相关 [6] [7] [8] [9] 。通过研究栘衣多酚氧化酶活性和总酚含量及其变化规律,可指导用于无性繁殖的取材,提高繁殖成活率,扩大种群数量,保护该种群。同时,也为以后栘衣的研究及培育提供一定参考基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料
以栘衣嫩枝和叶柄为材料,测定一年内每个月栘衣的多酚氧化酶(PPO)活性和总酚含量动态变化情况。
2.2. 多酚氧化酶活性测定
2.2.1. 酶液提取制备
取栘衣嫩枝的一段茎2.0 g绞碎,加入少许石英砂和0.02 g PVP粉,然后加入0.1 mol·L−1磷酸缓冲液(pH 7.0) 10 mL,在冰浴上混合均匀,10,000 rpm离心20分钟,将上清液倒入25 mL容量瓶,沉淀后用5 mL磷酸缓冲液再提取1次,上清液并入容量瓶,定容备用。
2.2.2. 酶活性分析与酶活力计算
取0.2 mL酶液于试管中,加入0.1 mol·L−1磷酸缓冲液(pH 7.0) 3 mL混匀,放置于25℃水浴中10分钟,再加入0.1 mol·L−1邻苯二酚0.5 mL,立即于470 nm波长测定OD值,以0.1 mol·L−1磷酸缓冲液(pH 7.0)作为对照,每30秒读数1次,测定分析5次。酶活力是以每分钟(min)每克(g)鲜样材料光密度增加0.01为1个酶活性单位(U),计算公式为:U= ΔOD/0.01 × t ×W其中,W为材料的鲜重。
2.2.3. 最佳分析测定条件筛选
设计不同pH值(分别为5.0、6.0、7.0、8.0)的缓冲液提取多酚氧化酶(PPO),用邻苯二酚(0.1 mol·L−1)测定分析其活性。缓冲液pH值设置为横坐标,酶活力设置为纵坐标,形成pH与酶活力的变化曲线,分析其最适pH值。
设计与制备浓度梯度为0.02 mol·L−1,0.06 mol·L−1,0.12 mol·L−1,0.15 mol·L−1,0.18 mol·L−1,0.22 mol·L−1的邻苯二酚溶液和浓度均为0.02 mol·L−1,0.06 mol·L−1,0.12 mol·L−1,0.15 mol·L−1,0.18 mol·L−1的肉桂酸溶液、阿魏酸溶液,依据酶活性分析系统,测定分析不同底物与浓度对多酚氧化酶活性的影响,分析其最适底物与浓度。
设置酶活力反应体系分别在15℃,25℃,35℃,45℃,55℃,65℃,75℃恒温环境下反应10分钟,测定分析不同温度条件对多酚氧化酶(PPO)活性的影响,筛选出最适处理温度。
2.3. 栘衣总酚含量测定
福林酚试剂配制和标准曲线的制作参见汪家政等 [10] 方法。
2.3.1. 福林酚试剂配制
向准备好的1 000 mL回流装置中加入钼酸钠
12.5 g
,钨酸钠
50 g
,蒸馏水350 mL,37%的浓盐酸50 mL,85%的浓磷酸25 mL,混匀充分,以小火焰回流10小时,再加入一水合硫酸锂
87.3 g
,蒸馏水25 mL,溴水2滴(瓶底可见溴滴1~2滴),接着拿下瓶盖让其继续沸腾15分钟,以使溴水完全挥发,冷却后可见溶液显黄色,稀释至500 mL,并过滤,然后将滤液倒入棕色试剂瓶保存待用。用时以标准NaOH溶液滴定,酚酞作为指示剂,当溶液的颜色由红变成紫红、紫灰,而后突然变成墨绿时即为终点,接着加水约1倍稀释,作为使用液。
2.3.2. 标准曲线的制作
将20 mg邻苯二酚,溶于100 mL 70%的丙酮中,配制成浓度为0.2 g·L−1的溶液,取蒸馏水2 mL稀释1倍,用作对照溶液。接着取刻度试管7支,分别移入0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL的对照溶液到试管里,再以70%的丙酮补足容积到1 mL;再另外取试管1支,移入70%的丙酮1 mL作为对照。然后分别移入福林酚试剂5 mL,混匀后静置3分钟,再加入20%的碳酸钠溶液2 mL,混匀后静置1小时,以蒸馏水定容至25 mL,在760 nm波长上测定分析吸光值。邻苯二酚含量设置为横坐标,吸收值设置为纵坐标,绘制形成标准曲线。线性回归方程为:Y = 0.0816X + 0.0094,R2 = 0.9994,以邻苯二酚含量表示试验样品的总酚物质含量。
2.3.3. 样品溶液准备
采取嫩枝的茎段,自然阴干,粉碎后过2毫米的筛子,称量5 g样品,倒入有塞子的锥形瓶里,加70%的丙酮100 mL,于80℃水浴里加热3小时,冷却并过滤,再将滤液定容到100 mL。
2.3.4. 样品溶液测定
取样品溶液1 mL加入到25 mL容量瓶中,以70%的丙酮定容。接着从定容后的容量瓶中取样液1 mL加入到刻度试管里,再加入福林酚试剂5 mL,混匀后静置3分钟,再加入10%的碳酸钠溶液5 mL,混匀后遮光静置1小时,以蒸馏水定容至25 mL;然后另外取试管1支,移入70%的丙酮1 mL作为对照,在760 nm波长上测定分析吸光值。
2.3.5. 分析结果与计算
1 g
样品的总酚含量(%) = ( a × v1 ×v3 )/(v2 × w ) × 10−6 × 100,式中:a为样液中总酚的含量(μg∙mL−1),v1为样品粉末定容后的体积(mL),v2为测定时量取的滤液体积(mL),v3为将v2滤液定容后的体积(mL),w为称样量(g)。
3. 结果与分析
3.1. 多酚氧化酶(PPO)活性与pH值变化的关系
栘衣多酚氧化酶(PPO)在不同的pH值情况下,它的活性也不相同(图1)。当pH值为5.0时,多酚氧化酶活性最小,随pH值的升高,活性也增加;当pH值达7.0时,酶活力单位最大,当pH值达8.0时,酶活力又降低。设置的pH梯度里,实验测定结果显示,当磷酸缓冲液pH值为7.0时,栘衣多酚氧化酶活性最大。因此,可认为pH值7.0是栘衣多酚氧化酶活性的实验最适pH值。
Figure 1. Effect of pH value on PPO activity of tender branches of Docynia indica
图1. pH值对栘衣嫩枝PPO活性影响
3.2. 不同底物及浓度与多酚氧化酶活性的关系
实验筛选设置的肉桂酸、阿魏酸和邻苯二酚作为底物时,实验明显显示以邻苯二酚作底物,栘衣多酚氧化酶(PPO)活性最高。故,以邻苯二酚作为实验的最适底物,同时设置邻苯二酚的浓度梯度开展进一步的实验分析。首先,随邻苯二酚浓度的升高,栘衣PPO活性也增加,但当浓度超过0.15 mol∙L−1时,PPO活性又开始逐渐降低。因此,整个实验分析揭示,筛选发现0.15 mol∙L−1的邻苯二酚为实验的最佳底物(图2)。
Figure 2. Effects of substrates and concentrations on PPO activity of Docynia indica
图2. 不同底物及浓度对栘衣PPO活性的影响
3.3. 温度与多酚氧化酶活性的关系
温度实验,设置在15℃~75℃温度区间内分析。温度达到25℃时,栘衣多酚氧化酶(PPO)活性最大;温度高于25℃时,PPO活性开始逐渐降低,随着温度升高到75℃时,PPO也基本丧失活性(图3)。因此,25℃是栘衣PPO活性在实验中的最适温度。
Figure 3. Effect of temperature on PPO activity of Docynia indica
图3. 温度对栘衣PPO活性的影响
3.4. 酶活性和总酚含量的动态变化
3.4.1. 多酚氧化酶活性月动态变化
针对栘衣新鲜材料,每月进行多酚氧化酶(PPO)活性分析测定,统计分析每月动态变化规律(图4)。实验分析显示,12月是PPO活性最低的月份,其次为1月、2月和10月;酶活性较高的月份是4月、7月、8月和9月,而且9月是PPO活性最高的月份。12月、1月和2月是冬季时节,植物生长缓慢,酶活性较低,变化也不明显;2~4月,6~9月,酶活性逐渐升高,可能是因为植物处于生长季节,体内的多酚氧化酶表现的较为活跃,活性显著高于休眠时节。
3.4.2. 总酚含量的动态变化
针对栘衣的总酚含量,实验设置每月进行测定,统计分析它的动态变化。采用福林酚试剂法,依据标准曲线与总酚含量计算公式分析出不同月份的栘衣茎段样品的总酚含量,绘制变化曲线,如图5所示。实验分析显示,总酚含量最低的是4月,其次为3月和9月,含量最高的月份为6月,其次为1月、7月、8月和11月。4月和9月分别为春初生长和秋末减缓的季节,而生长旺盛的6~8月以及步入休眠期的11月、12月和1月总酚含量均较高,揭示栘衣生长中的总酚含量与物候期有较为密切的关系。
Figure 4. Dynamic changes of PPO activity in Docynia indica
图4. 栘衣植株PPO活性动态变化
Figure 5. Monthly dynamic change of total phenol content in Docynia indica
图5. 栘衣植株总酚含量月动态变化
4. 讨论
与已经报道的一些植物相比 [4] [6] [7] [8] ,其PPO活性存在一定差异,表明各植物的PPO变化有自身特有的规律。磷酸缓冲液pH值对栘衣PPO活性具有明显影响,在酸性条件下,随pH值升高,PPO活性显著增强,当pH值为7时,PPO活性最高,pH值超过7为碱性,随pH值增大,PPO活性开始下降,则可认为在测定栘衣PPO活性的最适pH值为7.0。其次,阿魏酸、邻苯二酚和肉桂酸3种底物中,以邻苯二酚效果最好,但其浓度对栘衣PPO活性有显著影响,试验筛选出0.15 mol∙L−1邻苯二酚为最佳底物及浓度。再次,测试温度对栘衣PPO活性影响极显著,在15℃~75℃温度范围内,当温度为25℃时,栘衣PPO活性最高,超过25℃时其PPO活性逐渐降低,当温度达到75℃时,其活性基本失活;故认为测定栘衣PPO活性最佳温度为25℃。最后,栘衣PPO活性,在生长期明显高于休眠期。栘衣枝条体内总酚含量在每年的4月、5月、9月3个时段最低,为无性繁殖取材最佳时间。
总之,栘衣多酚氧化酶活性及性质与其他植物较为接近,属于正常情况,但酶活性在时间上变化较为滞后 [3] ,从而导致栘衣在开花及果实发育与成熟等阶段相对与其他常见植物品种较为延后。因此,本研究对以后栘衣的研究及培育有重要的指导意义。
基金项目
四川省科技计划项目(2018NZ0091)、四川省级公益性科研院所基本科研业务费项目、农业农村部杂粮加工重点实验室开放基金资助(No. 2018CC12)共同资助。
NOTES
*通讯作者。