不同试剂对多花黄精种子萌发和生长的影响

Effects of Different Reagents on Germination and Growth of Polygonatum cyrtonema Seeds

摘要: 目的：旨在解决多花黄精有性繁殖育苗的种子休眠问题，研究不同试剂处理及浸种时间对多花黄精种子萌发的影响。方法：将采回的多花黄精种子用钨酸钠(588、1176、1764、2352 mg/L)和氟啶酮(5、10、15、20 mg/L)两种试剂，分别与浸种时间(12 h、18 h、24 h)组合处理，用无菌水处理作为对照，70 d后对种子发芽率、发芽势、烂种率以及初生根茎芽长、芽粗、根长、根数、根粗、球茎长、球茎宽进行统计。结果：两种试剂处理均能不同程度破除种子的休眠，提高萌发，其中氟啶酮10 mg/L，浸种24 h和钨酸钠588 mg/L，浸种12 h分别是两种试剂中的最优处理，主成分综合得分分别是1.58、0.12。结论：氟啶酮和钨酸钠处理多花黄精种子，能不同程度打破种子休眠限制，提高萌发率。

Abstract: Objective: To solve the problem of seed dormancy in the sexual propagation of Polygonatum cyrtonema seedlings, and to study the effects of different reagent treatments and soaking time on the germination of Polygonatum cyrtonema seeds. Methods: The collected Polygonatum cyrtonema seeds were treated with two reagents, sodium tungstate (588, 1176, 1764, 2352 mg/L) and fluridone (5, 10, 15, 20 mg/L), respectively, and the soaking time (12 h) was used, (18 h, 24 h) combined treatment, treated with sterile water as a control, after 70 d, the seed germination rate, germination potential, seed rot rate, and primary rhizome shoot length, shoot thickness, root length, root number, root thickness, bulb length, bulb width for statistics. Results: Both treatments could break the dormancy of seeds to different degrees and improve germination. Among them, fluridone 10 mg/L, seed soaking for 24 h and sodium tungstate 588 mg/L, seed soaking for 12 h were the optimal treatments, respectively. The composite scores of components were 1.58 and 0.12, respectively. Conclusion: Fluridone and sodium tungstate treatment of Polygonatum cyrtonema seeds can break the seed dormancy limit to different degrees and improve the germination rate.

1. 引言

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum. Mill.)多年生草本植物，为药食两用植物，以根茎入药，具有补气养阴、健脾润肺、降血压、降血糖、降血脂、提高免疫力等功效 [1] [2] [3] [4] [5]。近年来，随着人们对多花黄精药用及保健价值的深入了解，导致其市场需求量增加，从而驱使农户对野生多花黄精进行大量采挖，这不仅会破坏生境，而且会导致野生多花黄精产量下降，为了应对这一系列难题，人工栽培势在必行。

1.1. 本研究领域存在的主要问题

首先，多花黄精包括有性繁殖(种子繁殖)和无性繁殖(根茎繁殖)两种繁殖方式 [6]，其中，根茎繁殖为传统繁殖方式。由于根茎繁殖具有成本高且易导致品种的退化的特点，同时影响药材质量，所以不利于大面积推广。

其次，在面对多花黄精药材市场的扩大的现状，传统的根茎繁殖已经渐渐不能满足需求。因此，大众的目光聚焦到了有性繁殖，该方式通过种子繁殖产生初生根茎，再经过培育能得到大量的种苗，这种方式能降低生产成本。但由于多花黄精种子具有休眠现象，使得多花黄精资源开发利用、人工育种栽培面临困难，所以解决多花黄精种子休眠问题是关键。

1.2. 研究进展

目前很多学者对种子休眠原因及打破种子休眠进行了大量研究，王锐等 [7] 研究了不同生长物质处理剂对梵净山多花黄精种子萌发的影响，结果表明苄氨基腺嘌呤(BA)、赤霉素(GA₃)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)均可打破种子休眠，提高萌发率。朱伍凤等 [8] 研究了外源生长调节物质对黄精种子萌发的影响，结果表明，适宜浓度的赤霉素(GA₃)、苄氨基腺嘌呤(6-BA)、水杨酸和壳聚糖均能促进黄精种子萌发，显著缩短发芽时间。焦劼等 [9] 研究了外源生长调节物质硝普酸钠(SNP)和乙烯(ETH)对黄精种子萌发的影响，得出两者均有打破种子休眠促进种子萌发的作用。

氟啶酮是ABA的合成抑制剂，可以通过抑制种子类胡萝卜素的合成从而减少ABA的合成 [10]。赵程等 [11] 研究了GA₃和氟啶酮(FL)协同作用对肉苁蓉种子发芽的影响，发现2种植物生长调节剂组合单一处理以及组合处理均可有效提高肉苁蓉种子的发芽率，其中10 mg/L质量浓度预处理肉苁蓉种子36 h种子发芽率最高。汪佳维等 [12] 研究了不同质量不同试剂及温度对解除滇重楼种子休眠的影响，得出赤霉素(GA₃)、氟啶酮(FL)单独处理以及组合处理均能打破种子休眠，其中GA300 + FL10是解除滇重楼种子休眠的最佳植物生长调节剂处理。苏贺等 [13] 研究发现，赤霉素、氟啶酮和发芽温度均可显著影响巫山淫羊藿种子休眠，其中氟啶酮效应最强，温度其次，赤霉素影响最小，对于氟啶酮而言，低温下10 mg/L质量浓度最佳，在高温和变温条件下，20 mg/L质量浓度最佳；而且研究结果还发现，氟啶酮可以使得巫山淫羊藿种子在变温中萌发，缩小了发芽的局限性。钨酸钠也是ABA合成抑制剂。郭栋梁等 [14] 研究了外源脱落酸抑制花生种子发芽的生理机制，用ABA合成抑制剂钨酸钠处理花生种子，结果表明，不同浓度钨酸钠溶液浸种对花生种子的发芽率没有影响，但是影响胚根长度钨酸钠处理浓度为8 mmol/L时，胚根长度下降，5 mmol/L钨酸钠处理的花生种子发芽率和活力指数提高，并且胚根长度大于对照处理的种子，生理指标显示α-淀粉酶活性提高，内源ABA含量降低。苏静 [15] 研究发现，喷施钨酸钠能促进新梢生长，抑制花芽形成；抑制叶片和叶片总糖、葡萄糖、果糖和蔗糖的积累等作用。

1.3. 本研究拟解决的关键问题及意义

解除黄精属植物种子休眠的外源物质渐渐变得多元化，适应的范围也越来越广，氟啶酮已经证明有解除休眠的性质，但在多花黄精种子中的作用还未见报道，钨酸钠能增强花生种子发芽质量，但在多花黄精种子中也未见报道。因此，本研究设置了不同种类和浓度的试剂结合不同浸种时间进行多花黄精种子萌发实验，研究多花黄精种子萌发特性，以期为打破多花黄精种子休眠、提高发芽率、缩短育苗时间提供指导。

2. 试验材料与仪器

2.1. 试验材料

种子于2021年10月下旬采自贵州铜仁印江县

2.2. 试剂

钨酸钠(Science Lab)、氟啶酮(Fluka)、次氯酸钠(山东化工)、0.1 M磷酸盐缓冲液(biosharp)。

2.3. 仪器

LGZ智能光照培养箱(杭州绿博仪器有限公司)、直尺、游标卡尺、万分之一电子天平(奥豪斯仪器有限公司)、培养皿、刀片、水浴锅(常州市鸿科仪器厂)、烘箱。

3. 试验方法

将采回的多花黄精果实，用清水浸泡后搓去果皮，种子洗净后存放在阴凉通风处备用。

3.1. 多花黄精种子形态特征和千粒质量测定

观测外部形态特征，随机选取净种处理后健康饱满的多花黄精种子100粒，测量种子的长、宽、厚度等数据；采用百粒法测定其千粒质量，种子千粒质量(g) = 10 × 平均100粒种子质量(g)，对各指标参数的最大值、最小值和平均值进行比较分析。

3.2. 多花黄精种子生活力的测定

参照索莱宝2,3,5-三苯基氯化思氮唑(TTC)法测定。

3.3. 不同试剂处理对多花黄精种子发芽的影响

分别用质量浓度为0、5、10、15、20 mgL的氟啶酮，0、588、1176、1764、2352 mg/L的钨酸钠，对多花黄精种子浸种12、18、24 h处理，根据发芽率、发芽势和烂种率统计结果。将预处理后的种子2%次氯酸钠溶液消毒10~15 min，再用无菌水冲洗干净，采用双层滤纸培养法将消毒后的种子置于垫有棉花及双层滤纸的发芽盒内，每盒100粒，每个处理重复3次，放入智能光照培养箱内，25℃恒温黑暗条件培养，每隔2 d定期观察并统计，胚根突破种皮并长至种子一半视为发芽，在培养过程中及时将发霉种子挑出并计数，若发现滤纸发霉应及时更换，全程均采用无菌水。

$发芽率=发芽数/种子总数\times 100\%$

$发芽势=第28天的发芽数/种子总数\times 100\%$

$烂种率=霉烂种子数/种子总数\times 100\%$

3.4. 不同试剂处理对多花黄精初生根茎的影响

当最终统计发芽率后，从每个重复中随机挑选3个初生根茎，测定其芽长、芽粗、根长、根粗、根数、球茎长以及球茎宽。

3.5. 数据整理及分析

采用Excel 2003和SPSS 26.0进行整理并统计数据以及方差分析及主成分分析。

4. 结果及分析

4.1. 多花黄精种子的种子生活力、外部形态特征及千粒质量

经过TTC法测定得出使用的多花黄精种子生活力为29.5%。通过对采集到的多花黄精的种子形态进行比较，种子的大小差异明显，而千粒重的差异相对来说就比较小(见表1)。

Table 1. Basic indexes of Polygonatum cyrtonema seeds

表1. 多花黄精种子基础指标

4.2. 浸种时间、氟啶酮、钨酸钠对多花黄精种子发芽率、发芽势及烂种率影响方差分析

氟啶酮对多花黄精种子发芽率影响显著(P < 0.05)，而浸种时间影响不显著(P为0.445)，浸种时间–氟啶酮交互作用显著(P < 0.05)。此外，由F可知，氟啶酮对发芽率的影响强于浸种时间–氟啶酮(F分别为45.196，2.404)。氟啶酮对多花黄精种子发芽势影响显著(P < 0.05)，而浸种时间影响不显著(P为0.668)，浸种时间–氟啶酮交互作用显著(P < 0.05)。此外，由F可知，氟啶酮(F = 11.310)对发芽势的影响强于浸种时间–氟啶酮(2.302)。氟啶酮和浸种时间对多花黄精种子烂种率影响显著(P < 0.05)，而浸种时间–氟啶酮交互作用不显著(P = 0.196)。由F可知，氟啶酮浓度是两因素中效应最强的因素(F = 29.032)，其次是时间(F = 4.620)，见表2。

Table 2. Analysis of variance for the effect of time and fluridone on the germination of Polygonatum cyrtonema

表2. 时间、氟啶酮对多花黄精发芽影响方差分析

钨酸钠对多花黄精种子发芽率、发芽势以及烂种率影响均显著(P < 0.05)，而浸种时间影响均不显著(P分别为0.531，0.931，0.193)，且浸种时间-钨酸钠交互作用也均不显著(P分别是0.721，0.365，0.300)，见表3。

Table 3. Analysis of variance for the effect of time and sodium tungstate on the germination of Polygonatum cyrtonema

表3. 时间、钨酸钠对多花黄精发芽影响方差分析

4.3. 不同试剂浓度对多花黄精种子发芽率及发芽势的影响

4.3.1. 氟啶酮浓度对多花黄精种子发芽率及发芽势的影响

由图1可知，用氟啶酮处理均可显著增加种子发芽率(P < 0.05)，在浸种12 h后，随着氟啶酮浓度升高对种子发芽率均有不同程度的增加，其中，浓度为10、15和20 mg/L时，其发芽率显著高于5 mg/L时的发芽率，但10、15和20 mg/L三组处理的发芽率无显著差异；浸种18 h和24 h后，随着氟啶酮浓度的升高，其种子发芽率均显著高于对照组，但四组氟啶酮浓度处理的种子发芽率无显著差异；在浸种时间为12 h、18 h和24 h时，发芽率最好对应的氟啶酮浓度分别为20 mg/L、10 mg/L、20 mg/L，其发芽率分别对应25.33%、28%、30%。

浸种12 h，不同浓度氟啶酮处理多花黄精种子均可显著提高其发芽势(P < 0.05)，其中，在20 mg/L氟啶酮处理下发芽势最高，为4.33%；浸种时间为18 h，不同浓度氟啶酮处理多花黄精种子均不同程度显著提高其发芽势(P < 0.05)，但20 mg/L氟啶酮处理与对照相比差异不显著，其中，在10 mg/L氟啶酮处理下发芽势最高，为5.33%；浸种24 h，不同浓度氟啶酮处理多花黄精种子均可显著提高其发芽势，但15 mg/L和20 mg/L浓度下发芽率相比对照差异不显著，其中在10 mg/L氟啶酮处理下发芽势最高，为6% (见图1)。

Figure 1. Effects of different concentrations of fluridone on the germination of Polygonatum cyrtonema seeds under different soaking time treatments

图1. 氟啶酮不同浓度在不同浸种时间处理下对多花黄精种子发芽的影响

Figure 2. The effect of different concentrations of sodium tungstate on the germination of Polygonatum cyrtonema seeds under different soaking time treatments

图2. 钨酸钠不同浓度在不同浸种时间处理下对多花黄精种子发芽的影响

4.3.2. 钨酸钠浓度对多花黄精种子发芽率及发芽势的影响

由图2可知，浸种12 h，不同浓度钨酸钠处理均可显著提高多花黄精种子的发芽率(P < 0.05)，但处理组间差异不显著，其中，在588 mg/L钨酸钠处理下发芽率最高，为19%；浸种18 h，不同浓度钨酸钠处理均可显著提高多花黄精种子的发芽率(P < 0.05)，但处理组间差异不显著，其中，在1176 mg/L钨酸钠处理下发芽率最高，为18%；浸种24 h，不同浓度钨酸钠处理均可显著提高多花黄精种子的发芽率(P < 0.05)，但处理组间差异不显著，其中，在1176和2352 mg/L钨酸钠处理下发芽率最高，均为19.33%。

浸种12 h后，用钨酸钠处理可显著增加种子发芽率(P < 0.05)随着氟啶酮浓度升高对种子发芽率均有不同程度的增加，但处理浓度1176 mg/L下的发芽势与对照组差异不显著，且处理组之间差异也不显著；浸种18 h，虽然发芽相比对照均有增加，但差异均不显著；浸种24 h，随着钨酸钠浓度的变化，增加的趋势均有不同，除了浓度2352 mg/L相比对照差异显著意外，其他处理组均不显著；在浸种时间为12 h、18 h和24 h时，发芽势最好对应的钨酸钠浓度分别为1764 mg/L、2352 mg/L、2352 mg/L，其发芽率分别对应2.67%、2.33%、3.33% (见图2)。

4.4. 不同试剂浓度处理对多花黄精初生根茎长势的影响

通过不同浓度氟啶酮、不同浸种时间处理，种子萌发形成的初生根茎生长指标见表4。其中，芽长、芽粗、根长、根数、根粗、球茎长和球茎宽平均数值为0.32 cm、1.08 mm、6.37 cm、3.59、0.75 mm、5.09 mm、3.79 mm，球茎宽的变异系数最小，为14.54%，数值在2.29~5.15 mm之间波动，表明该指标作为初生根茎的基础生长指标数值相对稳定；其次为根粗，变异系数为19.90%，其数值在0.29~1.25 mm之间；芽长的变异系数最大，为40.78%，数值波动范围在0.10~0.80 cm，表明在不同浓度氟啶酮及时间处理下，初生根茎芽长差异大。

在氟啶酮不同条件处理下均有不同程度的差异，当氟啶酮浓度为10 mg/L，浸种时间为18 h时，初生根茎芽长最长，数值为0.41 cm；当氟啶酮浓度为20 mg/L，浸种时间为12 h时，初生根茎根长最长，为7.49 cm；当氟啶酮浓度为15 mg/L，浸种时间为18 h时，初生根茎根数达到最多，为4.22；当氟啶酮浓度为20 mg/L，浸种时间为12 h时，初生根茎根粗达到最大，为0.81 mm；当氟啶酮浓度为10 mg/L，浸种时间为24 h时，球茎宽达到最大，为4.23 mm，但各处理之间芽粗和球茎长无显著差异。

Table 4. Effects of different concentrations of fluridone at different soaking time on primary rhizomes

表4. 不同浓度氟啶酮在不同浸种时间处理对初生根茎的影响

由表5可得，在钨酸钠不同浓度、不同时间处理下，初生根茎生长指标出现了不同程度的变化，平均值分别为芽长0.28 cm、芽粗1.17 mm、根长6.20 cm、根数3.78、根粗0.77 mm、球茎长4.90 mm、球茎宽3.71 mm，其中，变异系数最小为17.44% (球茎宽)，数值范围2.29~5.15 mm，表明该指标数值相对稳定，其次就是19.90% (根粗)，数值范围0.29~1.25 mm，变异系数最大的是40.78%，对应的指标为芽长，数值范围为0.10~0.80，表明在不同浓度钨酸钠处理下，初生根茎芽长差异最大。

不同处理下每个指标所对应的各处理间均有不同程度的差异，当钨酸钠浓度为1176 mg/L，浸种时间为18 h以及钨酸钠浓度为1764 mg/L，浸种时间为24 h时，其芽长均能达到最大值，为0.33 cm；当钨酸钠浓度为1176 mg/L，浸种时间为18 h时，初生根茎芽粗达到最大，为1.32 mm；当钨酸钠浓度为2352 mg/L，浸种时间为12 h时，初生根茎根长达到最大值，为7.14 cm；当钨酸钠浓度为2352 mg/L，浸种时间为12 h时，初生根茎球茎宽达到最大，为4.04 mm，但根数、根粗以及球茎长三个指标在各处理间均未达到显著差异。

Table 5. Effects of different concentrations of sodium tungstate at different soaking time on primary rhizomes

表5. 不同浓度钨酸钠在不同浸种时间处理对初生根茎的影响

4.5. 不同组合处理对多花黄精种子烂种率的影响

由图3可知，在不同浸种时间处理下，烂种率较高的均是对照，用氟啶酮处理多花黄精种子浸种12 h后，烂种率最高的是17.33%，对应浓度15 mg/L，浸种18 h后，烂种率最高的是21.67%，对应浓度是20 mg/L，浸种24 h后，烂种率最高是21.67%，对应浓度5 mg/L。

用钨酸钠处理多花黄精种子，浸种12 h，烂种率最高20.33%，对应1176 mg/L，浸种18 h烂种率最高22%，对应1764 mg/L，浸种24 h，烂种率最高17.33%，对应浓度2352 mg/L。

4.6. 主成分分析

利用SPSS26.0软件先对数据进行标准化处理，使其服从正态分布，并消除纲量影响，再进行主成分分析，提取出3个主成分，得到初始特征值(见表6)，得到主成分向量如表7所示。

Figure 3. Effects of different combination treatments on the rate of rotten seeds of Polygonatum cyrtonema

图3. 不同组合处理对多花黄精种子烂种率的影响

Table 6. Initial eigenvalues

表6. 初始特征值

Table 7. Principal component vectors

表7. 主成分向量

由表6可知：前3个主成分的累计方差贡献率达到了78.104% > 70%，且特征根均大于1，表明该降维方法具有有效性。

主成分函数方程：Y₁ = 0.139Z_发芽率 + 0.138Z_发芽势 + 0.161Z_芽长 + 0.140Z_芽粗 + 0.202Z_根长 + 0.171Z_根数 + 0.187Z_根粗 + 0.210Z_球茎长 + 0.211Z_球茎宽；Y₂ = 0.327Z_发芽率 + 0.317Z_发芽势 + 0.236Z_芽长 − 0.242Z_芽粗 − 0.052Z_根长 − 0.240Z_根数 − 0.171Z_根粗 + 0.013Z_球茎长 − 0.057Z_球茎宽；Y₃ = 0.060Z_发芽率 + 0.038Z_发芽势 + 0.487Z_芽长 + 0.448Z_芽粗 − 0.411Z_根长 + 0.168Z_根数 + 0.252Z_根粗 − 0.226Z_球茎长 − 0.473Z_球茎宽。

由表7可知：第1主成分中球茎长和球茎宽有较大的载荷系数，第2主成分中的发芽率和发芽势有较大的载荷系数，第3主成分中芽长和芽粗有较大的载荷系数，均成正相关。以3个主成分对应的方差贡献率为权重，不同处理的多花黄精种子相应的权重和主成分得分进行加权求和，再根据主成分特征值和主成分向量，可以计算出各主成分得分及综合得分，相关排名结果见表8，得到综合评分模型函数Y = 0.512Y₁ + 0.343Y₂ + 0.145Y₃，结果显示6号处理的综合评分达到了1.58，高于其他处理组，由此可对各处理下的多花黄精种子做出评价，排序从高到低为6号(F10 mg/L 24 h) > 5号(F10 mg/L 18 h) > 10号(F20 mg/L 12 h) > 12号(F20 mg/L 24 h) > 2号(F5 mg/L 18 h) > 8号(F15 mg/L 18 h) > 3号(F5 mg/L 24 h) > 9号(F15 mg/L 24 h) > 7号(F15 mg/L 12 h) > 13号(W588 mg/L 12 h) > 22号(W2352 mg/L 12 h) > 17号(W1176 mg/L 18 h) > 11号(F20 mg/L 18 h) > 4号(F10 mg/L 12 h) > 24号(W2352 mg/L 24 h) > 1号(F5 mg/L 12 h) > 19号(W1764 mg/L 12 h) > 23号(W2352 mg/L 18 h) > 15号(W588 mg/L 24 h) > 18号(W1176 mg/L 24 h) > 20号(W1764 mg/L 18 h) > 14号(W588 mg/L 18 h) > 21号(W1764 mg/L 24 h) > 16号(W1176 mg/L 12 h)。综合比较表明6号处理：用10 mg/L氟啶酮，浸种24 h处理多花黄精种子为最优的条件。(注：F表示氟啶酮处理，W表示钨酸钠处理)

Table 8. Scores of principal components and ranking of comprehensive scores

表8. 各主成分得分及综合得分排序

5. 结论与讨论

百合科药用植物种子质地坚硬，大多数的种子存在休眠现象，且百合科种子的休眠主要属于生理休眠，其种子成熟时往往形态还未成熟(胚未发育，停留在原球胚阶段)，胚的发育与温度密切相关，种子的休眠与各激素在种子中的绝对含量有关 [16]。刚采收的多花黄精种子ABA含量显著高于其他萌发出苗时期的多花黄精种子，会抑制种子萌发，而此时GA₃含量还很低，对种子萌发的促进作用较小；刚采收的多花黄精种子的种皮具蜡质，亮黄色，种皮外附有绿色物质，且无法完全洗去，而种皮的结构可以影响其透气性和透水性 [17]。

本试验中，创新了多花黄精种子破休眠的方法，结果显示：单独使用氟啶酮处理多花黄精种子表现出了促进萌发的作用，但随着浓度和浸种时间的变化，大多数处理组发芽率、发芽势等指标均不成规律变化，可能是由于实验前处理种子的选择以及浓度设置未达到一个差异的点。本试验还发现，钨酸钠处理多花黄精种子，其根长最高能高达12.90 cm，跟郭栋梁等 [14] 研究结果类似。由于本试验得到的试验结果并不理想，最高萌发率还未达到50%，同时只是探究了两种不同试剂对多花黄精种子解除休眠的影响，所以应进一步筛选更好的浓度以及组合处理来得到更加理想的效果。

结论：综合以上分析得出用10 mg/L氟啶酮浸泡多花黄精种子24 h为该试验中的最优处理方法。

基金项目

国家重点研发项目：西南地区天麻、三七等中药材产业关键技术研究与应用示范([2021]YFD1601000号)。

NOTES

^*通讯作者。