1. 引言
碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase, CA, EC 4.2.1.1)是一族含锌金属酶，其活性中心有一个催化所必需的Zn2+，催化CO2和HCO3−之间的相互转化(H2O + CO2 « H+ + HCO3− « CO32− + 2H+)，转化常数高达106 [1] [2] 。催化反应受pH的影响，pH < 6.4时CO2占优势，pH介于6.4~10.3时HCO3−占优势，pH > 10.3时CO32−占优势。没有碳酸酐酶的时候，CO2水合反应速率很慢，碳酸酐酶的加入几乎将反应速率提高了7个数量级，碳酸酐酶是迄今为止已知的催化速率最高的酶之一。碳酸酐酶目前的研究主要集中在碳酸酐酶的空间结构、酶学特性、生理功能、进化分类、参与植物和藻类等光合生物的光合作用的机制以及在人类医学领域的应用。
碳酸酐酶是一种与光合作用密切相关的酶，碳酸酐酶在所有利用CO2进行光合作用的绿色植物中都存在，从藻类，蕨类到高等被子植物都含有碳酸酐酶，而且含量还相当可观。碳酸酐酶在高等植物光合碳代谢中的生理功能可能是加速无机碳向RubisCO (核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)活性部位的扩散，保持RubisCO处在较高的无机碳浓度的微环境中，从而提高CO2的固定效率 [3] 。
对植物碳酸酐酶的研究仅限于少数几种植物，主要是拟南芥、豆类 [4] [5] 、玉米 [6] 、菠菜 [7] 、胡萝卜 [8] 等，对其CA的酶学特性包括动力学等都有较多研究。近年来研究表明，植物碳酸酐酶与环境逆境之间存在一定的应答关系。张悦扬等人研究发现烟草CA7基因(属于α-CA家族)在根、茎、叶、花中均有表达，在叶中表达量最高。同时，烟草CA7基因响应高盐、干旱、低钾、ABA、低温及H2O2的诱导表达，表明CA7基因可能在烟草非生物胁迫生理响应过程中发挥作用 [9] 。本文研究了干旱胁迫对甘蓝型油菜碳酸酐酶活性及相关生理指标的影响，旨在为碳酸酐酶活性与植物抗旱性之间的关系研究提供一定的研究基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料
以甘蓝型油菜为实验材料，采用的ZnSO4∙7H2O处理浓度为0.05% (W/V)和0.1% (W/V)。具体做法如下：将试验田中生长一致处于抽薹期的植株90株移栽到花盆中分成3组，每组30株。恢复培养一周后对第1组的叶片连续喷洒0.05% ZnSO4∙7H2O一周，每个单株喷洒10 mL，喷洒时力求每个叶片表面喷洒均匀，第2组喷洒浓度为0.1% ZnSO4∙7H2O，第3组喷洒等体积的双蒸水。在此期间每天浇1次水，每次每盆浇水100 mL，以保证油菜正常生长所需的水分。ZnSO4∙7H2O处理一周后，对材料进行持续干旱处理。在干旱的第13天开始恢复正常供水。在干旱的第1天、第6天、第12天、第15天、第17天测定各项生理指标。
2.2. 取样方法
上午9:00采集新鲜叶片，供试植物均取自第一片完全展开叶下数第2~4片功能叶。取第2片叶测定碳酸酐酶活性和光合作用，第3片叶测定丙二醛含量，第4片叶测定脯氨酸含量。
2.3. 测定方法
2.3.1. 植物碳酸酐酶的提取和测定方法
油菜叶片碳酸酐酶的提取方法参照Hatch等人 [10] 的方法略作修饰。取田间的新鲜油菜叶片
0.5 g
，立即液氮研磨，加5 mL提取缓冲液(50 mM Hepes-KOH含10 mM DTT，pH = 8.2)。12, 000 rpm，离心10 min，上清液储存在0℃待测。
碳酸酐酶活性的测定参照Brownell等 [11] 方法略作改进，在一个4℃的冷冻反应室中，加入5 mL测定缓冲液(20 mM巴比妥-KOH，pH = 8.3)和0.5 mL煮沸或未煮沸的样品液，打开磁力搅拌器持续地搅拌使混合均匀，再用注射器注入4.5 mL冰冷的CO2饱和水(蒸馏水在0℃冰水混合物中充CO2气体1 h获得的，浓度大约为
70 mM
)时反应开始，测定H2O + CO2 → HCO3− + H+过程导致的pH下降，用梅特勒pHs-320S酸度计监测pH从8.3下降到7.3所需的时间。碳酸酐酶的酶活单位(U)的计算公式为：U = 10 × (T0/T-1)，其中T0、T分别为煮沸杀死的样品液和未煮沸的样品液测得的pH变化所需的时间。碳酸酐酶活性以每克新鲜叶片(或根、茎)含有的酶活单位数表示(U.g−1 (FW))。所有数据均为3次测量的平均值。
2.3.2. 脯氨酸含量及丙二醛含量测定
参照李合生等介绍的方法进行 [12] 。
1) 脯氨酸含量的测定
绘制标准曲线，然后是油菜叶片脯氨酸含量的测定。步骤如下：
① 准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5 g，分别置大管中，然后向各管分别加入5 mL 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
② 吸取2mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。
③ 冷却后加入4 mL甲苯，摇荡30 s，静置片刻，取上层液10 mL至离心管中，在3000 r/min下离心5 min。
④ 用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在722型分光光度计上520 nm波长处比色，求得吸光度值。
根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出) 2 mL测定液中脯氨酸浓度x (μg/mL)，然后计算叶片中脯氨酸含量。计算公式如下：
2) 丙二醛含量的测定
① 取0.5 g植物叶片，加5%三氯乙酸5 mL，研磨后所得匀浆在3000 r/rpm下离心10 min。
② 取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸2 mL，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。
③ 分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值，并按下列公式算出MDA浓度C (μmol/L)，再算出单位鲜组织中的MDA含量(nmol/g)。
2.3.3. 光合作用指标的测量
用英国ppsystem公司生产的TPS-1便携式光合作用测定仪测定净光合速率(Pn)。净光合速率测定与碳酸酐酶活性测定同步进行，于上午9:00取油菜第2片叶测定净光合速率。
2.3.4. 数据分析
用Origin软件作图。
3. 结果与分析
3.1. 干旱过程中甘蓝型油菜叶片脯氨酸含量的变化
脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，以游离态广泛地存在植物体中。正常条件下，植物体中游离脯氨酸的含量不多，约在0.2~0.7 mg/g干重范围内，占总游离氨基酸的百分之几，但在逆境条件下(干旱、盐渍、冷冻等)植物体内游离脯氨酸可增加10~100倍，达到游离氨基酸的40%以上，尤其干旱胁迫下脯氨酸积累最多 [13] 。植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸，因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
从总体上讲，无论是锌预处理还是水预处理的油菜叶片，在干旱及复水后的脯氨酸变化都是呈现先升后降的趋势(图1)，但经过锌预处理的甘蓝型油菜的脯氨酸含量在整个过程都高于水预处理(对照组)的油菜叶片，这说明锌预处理对于诱导脯氨酸的产生有一定的作用。进一步分析发现，预处理用0.1% ZnSO4∙7H2O的效果比0.05% ZnSO4∙7H2O好，产生了更多的脯氨酸以对抗干旱胁迫。0.05% ZnSO4∙7H2O预处理的效果不是很明显。
图1. 干旱诱导及复水过程中叶片脯氨酸含量的变化
3.2. 干旱过程中甘蓝型油菜叶片丙二醛含量的变化
植物器官在遭受伤害时往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde, MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物。MDA可与细胞内的蛋白质、核酸等大分子发生反应，使蛋白质和核酸变性，还可使纤维素分子间的共价键松驰，对细胞进一步造成伤害。因此，MDA含量的多少，代表着植物细胞遭受逆境伤害的程度和膜脂过氧化程度 [14] 。
测定结果表明：在干旱过程中经不同处理的叶片MDA含量都出现不同程度的上升，复水后有下降的趋势。锌预处理的叶片中的MDA含量明显低于对照组的叶片MDA含量(图2)。特别是0.1% ZnSO4∙7H2O处理后的叶片，MDA含量在整个过程一直是三组中最低的，说明油菜器官受损害的程度最小。
图2. 干旱诱导及复水过程中叶片丙二醛含量的变化
3.3. 干旱过程中甘蓝型油菜叶片碳酸酐酶活性的变化
图3. 干旱诱导及复水过程中叶片碳酸酐酶活性的变化
从图3可以看出，总体上讲，在轻度干旱胁迫阶段，碳酸酐酶活性有不同程度的上升，随着干旱的加剧，碳酸酐酶活性出现不同程度的下降，其中对照组的下降幅度最大。复水后碳酸酐酶活性出现了不同程度的上升。在轻度干旱胁迫下，碳酸酐酶活性由于逆境诱导而有较大幅度上升，这促使CO2有效供给的增加，可在一定程度上补偿由于气孔关闭而导致的光合速率的下降。但是较强的干旱胁迫却导致碳酸酐酶活性的大幅度下降，说明植物的生理结构受到一定程度的破坏。锌预处理的油菜的碳酸酐酶活性均高于对照组，说明前期的喷锌处理明显提高了油菜叶片的碳酸酐酶活性，从而提高了油菜的抗旱性。
3.4. 干旱过程中甘蓝型油菜叶片净光合速率的变化
为研究不同处理油菜在干旱渐进以及复水过程中的光合速率特征，本文还连续观测了不同实验组油菜在上午9:00的净光合速率，进而了解植物对干旱胁迫在光合速率上作出的响应机制。通过图4可以看出在干旱渐进过程中净光合速率呈下降趋势，复水后净光合速率开始上升。当受轻度干旱胁迫时，净光合速率缓慢下降，随着干旱的加剧，净光合速率出现较大幅度的下降，下降的幅度随干旱程度的增加而增大。锌预处理的油菜叶片净光合速率始终最大，说明锌预处理油菜叶片的碳酸酐酶活性升高，从而使净光合速率不至于降得太低。而且前面已经提到在整个过程中0.1% ZnSO4∙7H2O处理后的油菜叶片中积累的丙二醛最少，说明油菜受到的损害较小；脯氨酸含量最多，这些渗透调节物质的大量积累有利于提高油菜的抗旱性。受损程度较小的植物复水后的恢复能力较强，从图4可以看出0.1% ZnSO4∙7H2O处理后的油菜叶片在复水后净光合速率上升较快。
图4. 干旱诱导及复水过程中叶片净光合速率的变化
4. 讨论
从总体上讲，干旱胁迫时甘蓝型油菜叶片的脯氨酸含量和丙二醛含量升高，净光合速率降低，而碳酸酐酶活性则是先升高后降低。植物在适应干旱环境时经常会积累一些渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性糖等。大量研究证明，在干旱时一般会出现植物的脯氨酸、可溶性糖以及丙二醛等含量随着干旱胁迫的加剧而增加的现象。本研究也验证了油菜叶片的脯氨酸含量和丙二醛含量在干旱胁迫时显著增加。当植物遭受轻度或中度干旱时，叶片气孔导度下降，造成叶内细胞间隙CO2浓度降低而导致光合速率下降。干旱胁迫对植物光合作用的影响比较复杂，它不仅使光合速率降低，而且还会抑制光合作用光反应中原初光能转换电子传递光合磷酸化和光合作用暗反应过程，最终导致光合作用下降 [15] 。本研究也验证了在渐进干旱的过程中净光合速率明显下降。
适当浓度的喷锌预处理可以提高油菜在干旱处理前的碳酸酐酶活性。在进行干旱诱导过程中，锌预处理组油菜与对照组(未喷锌组)油菜相比，碳酸酐酶活性始终较高，脯氨酸积累较多，丙二醛积累较少，油菜受到的伤害较小。这表明叶面喷锌有助于提高甘蓝型油菜的抗旱性。从图1至图4可以看出，锌处理的两组油菜的抗旱性比对照组的抗旱性强，特别是0.1% ZnSO4∙7H2O预处理的效果最明显。
王力敏等研究发现干旱胁迫期间油菜β CA1的Tyr207磷酸化水平下调，干旱胁迫抑制油菜碳酸酐酶活性 [16] 。孙卫红研究发现，在干旱胁迫诱导下番茄碳酸酐酶基因表达量随时间呈现先升后降的趋势 [17] 。本研究发现干旱诱导过程中油菜叶片碳酸酐酶活性同样出现了先升后降的趋势，与孙卫红的研究结果一致。作者在以前的研究中发现，叶面喷锌可以提高油菜的碳酸酐酶活性。本文研究了油菜碳酸酐酶活性与抗旱性的关系，结果表明：叶面喷锌提高了油菜碳酸酐酶活性，进而提高了油菜的抗旱性，进一步说明高碳酸酐酶活性的油菜具有较强的抗旱性。
NOTES
*通讯作者。