传染性造血器官坏死(Infectious haematopoietic necrosis, IHN)是严重危害我国鲤、鳟鱼苗种业的一种病毒性疾病 [1] 。而传染性胰脏坏死(Infectious pancreatic necrosis, IPN)是一种由传染性胰脏坏死病毒引起鲑科鱼类的病毒性传染病,以前称其为急性卡他性肠炎,分为急性、亚急性和慢性3种 [2] 。IHN、IPN被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病,被我国列为二、三类动物疫病 [3] 。为了预防和控制IHN、IPN的流行,对它们进行流行病学监测和诊断是十分重要的。因此,建立快速简便的IHN、IPNV检测方法,有利于对疫病爆发进行及时的监测、预防和控制,也是保证国内水产养殖业健康发展及促进出口贸易的有效手段。
1. 材料与方法
1.1. 实验所用的材料
氯金酸、碳二亚胺、兔抗鼠二抗购自Sigma公司,柠檬酸三钠(分析纯)、BSA购自上海惠世有限公司。硝酸纤维素膜、玻璃纤维、玻璃棉、吸水纸、支持板:德国S.S公司产品。实验用水均为经超纯水装置净化的二次去离子水,电阻率 ≥
18.2 M
Ω。IHNV、IPNV、SVCV、VHSV、EHNV、KHV等病毒均由本实验室保存
1.2. 主要溶液的配制 [4]
见2.1中的溶液名称。
1.3. 主要仪器设备
分析天平、直流(数显)无级调速搅拌器、恒温数显加热套、紫外可见光分光光度仪、透射电子显微镜、粒度测定仪。
1.4. 临床样本
临床62份鱼类样本:2014~2016年期间辽宁地区采集;
16份IHNV与IPNV的阳性样本:由本实验室分离、鉴定、保存。
1.5. 方法
1.5.1. 胶体金标记单克隆抗体的制备 [5] 以及检测线和对照线的制备
用Bio-Dot XYZ-3050自动喷膜机分别将2 mg/mL纯化的多抗和1 mg/mL SPA点在硝酸纤维膜上检测线和对照线位置,点样速度为0.75 μL/cm。
37 ℃
干燥2 h后,
4 ℃
密封保存备用。
1.5.2. 胶体金试纸条的组装及试验结果判定
将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起,利用Bio-Dot CM4000切条机将其切成3.5 mm宽的试纸条,于
4 ℃
干燥保存备用。用试纸条检测,如果对照线和检测线均显色,则为阳性,如果仅对照线显色,而检测线不显色,则为阴性,如果对照线不显色,则检测无效,应换用另一根试纸条再次检测。
2. 结果与讨论
2.1. 抗体纯化
将制备好的抗体用20 mM PBS PH7.0的缓冲液进行10倍稀释,稀释后的样品过0.45um的针头滤器和Mabselect 5 ml的预装柱(平衡Buffer:20 mM PBS PH7.0、洗脱Buffer:100 mM Gly-HCL PH3.0)。制备出的目的蛋白加入
1 M
Tris-HCL PH 9.0的溶液进行中和,中和后的目的蛋白再过G 25的柱子进行脱盐,置换溶液是20 mM PBS PH7.0。最后跑电泳,用BCA的方法测蛋白浓度。结果见图1。
2.2. 抗体标记
1m
胶体金中加入20 ug的待标记抗体,包被多克隆抗体,包被浓度为1.5 mg/mlL,样稀主要成分为10 mM PBS PH = 7.3。
经图2数据,得出结论:IHN、IPN抗体配对结果较好,符合使用要求。
2.3. 重复性试验
对实验室保存的16份IHNV、IPNV阳性样本进行检测显示试纸条具有较好的重复性;稳定性实验结果显示(见图3),置于
37 ℃
及
4 ℃
保存的试纸条,在保存3个月后反应,结果无明显差异,置于
50 ℃
保
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Figure 1. Electrophoresis identification results
图1. 电泳鉴定结果
存的试纸条从第2个月开始,敏感性下降,质控线和检测线变得模糊不清。
2.4. 灵敏性试验
试纸条可检出滴度为103.5TCID 50/100 uL的病毒悬液,仅与IHNV、IPNV病毒悬液呈阳性反应,其余均为阴性,如图4所示。
2.5. 梯度加样测试
如图5所示,结果表明,样本加样量等差递减,然后补充样本稀释液后,产品显色成梯度变化。符合产品检测性能需求。
2.6. 特异性试验
特异性试验结果发现对相应抗原抗体的检测呈阳性,对PFRV、HRV、IPNV、VNNV、YAV、GCRV、KHV等病毒的检测均为阴性(表1、表2)。
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Figure 3. Results of repeated experiment
图3. 重复性实验结果
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Figure 5. Gradient addition test IPN test strip
图5. 梯度加样测试IPN试纸条
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. Specific test results of IHNV colloidal gold test strip
表1. IHNV胶体金试纸条特异性试验结果
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Specific test results of IPNV colloidal gold test strip
表2. IPNV胶体金试纸条特异性试验结果
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 3. Results of clinical samples
表3. 临床样本检测结果
2.7. 临床样本检测
对采自本溪、丹东、东港、营口、鲅鱼圈、抚顺、朝阳、沈阳等地的62份样品,同时用试纸条和世界动物卫生组织所推荐的PCR方法进行检测。检测结果显示(表3) 12份样品使用PCR方法和试纸条检测均为阳性;49份样品均为阴性;1份样品PCR为阳性,试纸条为阴性;1份样品PCR方法检测为阴性,用试纸条检测为阳性。根据OIE手册中检测方法的确认一章所推荐的计算方法,本试纸条灵敏度为12/(12 + 1) × 100% = 92.3%,特异性为49/(49 + 1) × 100% = 98.0%,与PCR方法的符合率为(12 + 49)/62 × 100% = 98.4%。该试纸条显示出较好的特异性,适用于疾病爆发期间的诊断以及病毒分离产物的鉴定,但不适用于IHNV、IPNV的监测和发病早期诊断。
3. 结论
本文制备了IHNV与IPNV得胶体金快速检测试纸,并对其性能进行检测。结果表明所研制的试纸特异性良好,分别对鲤春血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)等常见病原菌进行测试未出现交叉反应;敏感度达到105 CFU/mL,反应时间仅为5 min~10 min,可以用于感染2种病原的病鱼腹水现场检测。免疫层析试纸条除操作简便和快速外,还具备了灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,操作时也不需要特殊试验条件,肉眼易于判断结果 [6] 。所以,此法是一项适宜在广大基层单位推广和应用的检疫技术。
基金项目
国家质检公益项目(201410059)。