1. 引言
胶原蛋白属于细胞外基质的结构蛋白质,是细胞外基质的主要成分,相对分子质量约为300 kDa,含有一个或几个由α链组成的三螺旋结构的区域,是哺乳动物体内含量最多(约占总蛋白的25%~30%),分布最广的功能性蛋白。胶原作为一种纤维状蛋白,可作为组织工程支架的优良生物材料 [1] [2] 。胶原作为生物医学材料,具有免疫原性低、生物相容性好、可生物降解、可止血等特点 [3] [4] [5] [6] [7] ,此外,胶原的三螺旋结构及自身的交联结构使其具有较高的强度,可满足机体对机械强度的要求,已成为组织工程中重要的角色。
脱细胞猪小肠粘膜下层基质是以猪小肠粘膜下层(SIS)为原料,通过脱细胞、成型和灭菌等工艺制备而成的膜状生物材料,其主要成分为胶原蛋白,还包含纤维连接蛋白、层粘连蛋白、生长因子等生物活性功能分子。现已广泛应用于肌腱、硬脑膜、腹壁等组织的修复以及重建。此外,也有报道将牛真皮、牛跟腱、猪皮等制备的胶原蛋白产品应用于临床治疗,具有良好的治疗效果 [8] - [13] 。
本文对比考察了猪小肠粘膜下层基质材料(VIDASIS)、进口猪小肠粘膜下层基质材料(BIODESIGN)以及市售脱细胞牛真皮基质(ADM)和胶原海绵(CS)四种胶原蛋白生物材料的物理性能,包括形貌、粗糙度、孔隙率、亲水性、力学强度以及变性温度,从而更加全面地掌握不同组织来源胶原蛋白生物材料的力学特性和物理性能,为产品不断提升品质提供参考价值。
2. 实验部分
2.1. 主要原料
脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(VIDASIS),北京博辉瑞进生物科技有限公司产品;脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(BIODESIGN),美国COOK生物公司产品;脱细胞真皮基质为采用牛真皮组织经脱细胞工艺处理后制备样品(AMD),烟台正海生物科技股份有限公司产品;胶原蛋白海绵为牛跟踺提取胶原蛋白经冷冻干燥制备样品(CS),天新福(北京)医疗器材股份有限公司产品。
2.2. 主要仪器
本研究所采用的主要仪器见表1。
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Table 1. Mainly used instruments in this study
表1. 本研究所使用的主要仪器
2.3. 形貌分析
通过扫描电镜观察四种样品的孔径和纤维结构。样品40℃条件下干燥24 h,离子溅射仪喷金,扫描电镜观察。
2.4. 表面粗糙度分析
利用德国布鲁克分析仪器公司的FastScan Bio原子力显微镜检测四组材料的粗糙度。扫描针尖采用Ф0.5 mm的高纯度钨,针尖与样品间的偏压为80 mV,扫描范围为1750 nm × 1750 nm,图像由Nano-Scope Analysis软件处理。
2.5. 孔隙率测定
用万分之一天平称量样品质量M,再用游标卡尺测量样品的尺寸并计算其视体积V,然后将样品放入样品杯中,利用真密度仪测量样品的真密度ρ真与样品的真实体积V真,再利用如下公式计算样品的孔隙率ε。
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其中,ρ视为视密度,ρ视 = M/V;
ρ真为真密度,即仪器的测量值。
2.6. 亲水性分析
将烘干的四种样品置于盖玻片上,将一滴水(约2 μL)滴在材料表面,用视频光学接触角测量仪测量水滴与材料的接触角,衡量材料的表面能。
2.7. 力学性能检测
将四种材料裁剪成宽度20 mm,长度30 mm的样品,夹具间的距离为15 mm,再将样品夹到夹具上,利用医药包装性能测试仪测量样品的力值、应力、应变及弹性模量。
2.8. 差热分析
将四种样品破碎成粉末,使用差热热重同步分析仪对样品进行差热和热重分析。最高温度600℃,升温速率10℃/min,气氛为空气。
3. 结果与讨论
3.1. 形貌分析
四种材料的表面及横截面形貌如图1所示,从图中可以看出两种SIS材料表面均可以看到胶原纤维
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Figure 1. Images of scanning electron microscope of four biomaterial samples
图1. 四种生物材料样品的扫描电镜图(a:VIDASIS表面;b:BIODESIGN表面;c:ADM表面;d:CS表面;e:VIDASIS侧面;f:BIODESIGN侧面;g:ADM侧面;h:CS侧面)
纵横交错排列,材料表面纤维明显,纤维直径约为1 μm,胶原纤维保留完好,长度在50 μm以上,未发现明显断裂纤维,都有连通孔通入材料内部。SIS纤维直径在从横截面形貌图可以看出两种SIS材料均为层状结构,分布均匀,但VIDASIS层间隙更大,更有利于新生细胞的进入生长。ADM表面较为平整,且致密,表面极少见连通孔,横截面存在许多孤立的块状物,为细胞外基质纤维的横切面,内部连通孔较多,此材料应为不同向的纤维堆叠而成。CS表面呈纤维细丝网状结构,从横截面形貌图可以看出材料孔径大小不一,孔连通性较好。总体而言,四种材料都有连通孔,但ADM表面致密平整,为微米级片状结构(长度在100 μm以上),限制了细胞的长入,BIODESIGN样品内部连通孔相对其他样品较差,VIDASIS和CS样品连通效果最好。而CS由于采用胶原蛋白溶液冷冻干燥工艺制备,因此孔隙连通结构最好,孔径范围50~200 μm。
3.2. 粗糙度分析
原子力显微镜分析样品的粗糙度,结果如表2所示。VIDASIS和BIODESIGN的粗糙度较小,ADM的粗糙度明显大于SIS材料的,Rq、Ra值分别为224 nm、185 nm,而SIS材料粗糙度在100 nm以下。SIS表面相对平整,更易于细胞迁移修复,从而减少粘连发生的风险。CS由于粗糙度太大,超出了原子力探针的测试范围,无法测出其粗糙度。
3.3. 孔隙率测定
孔隙率是表征组织工程支架材料的标准之一。一方面,支架的孔隙是细胞进入支架内部的通道;另一方面,支架的孔隙也是营养物质、气体以及植入细胞的代谢产物进出支架内部的重要通道。两种SIS材料都具有一定的孔隙率,有利于细胞和血管的长入,有利于组织的修复,减少修复材料在体内的降解时间,加快组织的修复和伤口的愈合,满足组织工程支架材料的基本要求。
如表3所示,VIDASIS、BIODESIGN、ADM和CS的孔隙率分别为45.82%、44.07%、74.99%和98.84%,两种SIS材料孔隙率相近,都为45%左右。CS孔隙率最高,由于生产工艺等原因,其产品为多孔海绵状三维结构。ADM的孔隙率介于SIS材料和CS材料之间。
3.4. 亲水性测试
如图2所示,VIDASIS材料的水接触角为45˚ ± 1.7˚,BIODESIGN材料为46˚ ± 2.1˚,ADM材料为
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Table 2. Results of roughness analysis by atomic force microscope
表2. 原子力显微镜分析样品粗糙度的结果
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Table 3. Results of porosity test of four biomaterial samples
表3. 四种生物材料样品的孔隙率测定结果
102˚ ± 0˚,CS为96.5˚ ± 4.95˚。水接触角是反应物质与液体润湿性关系的重要尺度,水接触角越小表明材料亲水性越好。两种SIS产品的水接触角没有明显差异且均小于90˚,说明两个公司生产的SIS材料都具有很好的亲水性。ADM和CS的水接触角均大于90˚,材料呈疏水性。亲水效果好,利于体液浸润材料及血管化,有利于将细胞长入材料内部,并逐步在材料内部填满新生细胞,促进组织修复过程,加快病患处的修复和愈合。
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Figure 2. Images of hydrophilicity test of four biomaterial samples
图2. 四种生物材料样品的亲水性测试图
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Figure 3. Results of mechanical properties of four biomaterial samples
图3. 四种生物材料样品的力学性能测试结果
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Figure 4. Results of differential scanning calorimetric test of four biomaterial samples
图4. 四种生物材料样品的差热分析结果(a: VIDASIS; b: BIODESIGN; c: ADM; d: CS)
3.5. 力学性能测试
力学性能测试结果如图3所示。VIDASIS最大力值为160.5 N,最大应力为40.1 MPa,最大应变为10%,弹性模量为124.43 MPa;BIODESIGN最大力值为157.5 N,最大应力为39.4 MPa,最大应变为12%,弹性模量为118.69 MPa;ADM的最大力值为184 N,最大应力为23.0 MPa,最大应变为31.3%,弹性模量为23.74 MPa;CS的最大力值为8.2 N,最大应力为0.072 MPa,最大应变为16.3%,弹性模量为4.78 MPa。综合比较,两种SIS材料的力学性能基本一致,且弹性模量明显优于其它两种材料,CS的力学性能较差。文献报道腹壁组织水平力学强度为10 ± 3.4 MPa,垂直力学强度为4.5 ± 2.0 MPa [14] ,因此两种SIS材料的力学强度可以满足腹壁修复要求,而CS材料由于力学性能较差,基本不可能用于腹壁缺损的修复。另外从材料极限伸长率进行对比,ADM材料弹性较大,其应变量为SIS材料的三倍以上,植入体内后随着胶原蛋白的降解与重塑,易发生收缩变形。
3.6. 差热分析
差热曲线可以反应材料物质相变、分解、化合、凝固、脱水、蒸发等物理或化学反应,因此可用于分析胶原蛋白的变性温度。如图4所示,四种材料的差热曲线表明在60℃~100℃附近存在一个热吸收峰,该峰为材料的变性温度,即胶原蛋白的三螺旋结构发生破坏的温度,VIDASIS、BIODESIGN、ADM和CS四种材料的变性温度分别为75.2℃、67.8℃、99.3℃和83.5℃,ADM、CS两种材料的变性温度明显高于SIS材料,ADM可能与含有弹性蛋白的约束有关,而CS材料的真空脱水工艺提高了胶原分子的变性温度。第二个吸热峰在220℃左右,四种材料差异不同,代表着胶原蛋白结构完全破坏。
四种材料的热重曲线均呈现出两个失重过程。第一阶段为室温至200℃,VIDASIS和BIODESIGN失重率皆约为10%左右,ADM和CS的失重率偏高些,约为15%,此过程是胶原样品中物理吸附水的解吸附过程;第二阶段为200℃至400℃,此过程是以胶原的热降解过程为主,也伴随着其它失重过程,如碳化和干馏等;而450℃以后的失重则更为复杂,主要是其热解产物发生碳化所引起的 [15] 。
4. 结论
本文考察了VIDASIS、BIODESIGN、ADM和CS四种胶原蛋白生物材料的物理性能。通过对比分析,不同组织来源与形式的胶原蛋白生物材料在特定的物理性能方面表现出差异性。
VIDASIS比BIODESIGN表面粗糙,前者孔隙率大于后者,CS的粗糙度和孔隙率比其他三者高,ADM介于三者之间。VIDASIS和BIODESIGN的亲水角比ADM和CS小,亲水性更好,更容易被体液润湿,可以与被修复组织更好地接触。VIDASIS和BIODESIGN力学强度最高,应变量小于ADM,CS的力学性能。正常情况下,人体胸部腹部肌肉收缩时胸压和腹压会升高,尤其是在咳嗽、排便以及重体力劳作时,压力上升尤为明显,修复受损的腹壁材料需要有一定的力学强度, CS的抗拉强度较低,无法满足使用要求,而SIS材料和ADM材料的抗拉强度远远超出腹壁的极限抗拉强度,满足腹壁损伤修复的使用要求。
基金项目
本研究得到国家863计划新材料领域专项(2015AA033602)和科技部中小企业创新基金(Z14010101281)的经费支持。