1. 引言
鹰嘴豆(Chickpea,Cicer arietinum)耐干旱、耐贫瘠又丰产,是目前世界上栽培面积较广的食用豆类作物之一,产量世界第三,在我国新疆、甘肃、宁夏等地已有2500多年的种植历史;鹰嘴豆不但具有很高的食用价值,而且还具有独特的药用价值;如鹰嘴豆对糖尿病、心脑血管疾病和胃病等疾病的预防和辅助治疗具有明显的效果,是维吾尔族药典传统用药 [1] [2] [3] 。
目前我国的鹰嘴豆精深加工水平还比较低,只是简单的磨粉或烘焙。近年来人们对鹰嘴豆蛋白肽的清除自由基、抗氧化、降血压等生理功能进行了研究 [4] [5] [6] ,而有关鹰嘴豆发酵方面的研究则还比较少。如热夏提·达吾来提、傅樱花等对鹰嘴豆酸奶的发酵条件、商品性能等进行了研究 [7] [8] ;王淑兰、孔令明等对鹰嘴豆蛋白饮料的工艺参数等进行了研究 [9] [10] ;这些研究对以鹰嘴豆为原料研发发酵饮料的工艺参数、产品性能等方面进行了探索,没有涉及纳豆激酶指标。另一方面,大量研究表明NK作为一种潜在的溶栓制剂,可以微生物发酵生产 [11] [12] [13] [14] [15] ,口服有效,受到中外学者和广大群众的普遍认可。卫拯友、魏雪团、肖萍等对鹰嘴豆固体发酵 [16] [17] 、液体发酵 [18] 制备纳豆激酶(Nattokinase,NK)的产酶条件、酶学性质等方面进行了探索,但所获得的NK单位酶活特别是固体发酵时还比较低,还有必要开展进一步的实验研究。为使鹰嘴豆发酵物料中NK的单位酶活得到进一步提高,本文在前人工作基础上,对发酵鹰嘴豆产NK的菌株和发酵参数开展了研究,并取得了较好的实验结果,现将我们的研究结果报道如下。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 菌株
本研究选用菌株为实验室分离保存的16株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)菌株。
2.1.2. 培养基
1) LB培养基:NaCl 1.0 g、蛋白胨1.0 g、酵母粉0.5 g、琼脂1.5 g、蒸馏水100 mL,pH值自然,121℃高压蒸汽灭菌25 min。
2) 发酵培养基:选取市售不同品种的鹰嘴豆,去杂,称重,浸泡过夜,滤去水分,根据各实验的具体要求进行处理,121℃高压蒸汽灭菌25 min。
2.1.3. 试剂
纤维蛋白原(Fibrinogen),凝血酶(Thrombin,690BP/支),尿激酶(Urokinase),购自中国药品生物制品检定所;琼脂糖、NaCl、蛋白胨,酵母粉;其它试剂均为国产分析纯。
2.2. 方法
2.2.1. 种子液制备
将菌株活化、转接至斜面培养基,37℃培养24 h。用接种环取1环接入LB培养基中,37℃、150 rpm/min培养过夜。
2.2.2. 菌株筛选及其发酵
菌种筛选时选用市场上常见的3个鹰嘴豆品种(大粒白色、大粒褐色和小粒白色品种)制作鹰嘴豆培养基,以较全面地考察菌株对鹰嘴豆培养基的适应能力和稳定性等;发酵实验每个三角瓶中装培养基质量为50克;液体种子接种量为4%,培养48 h,其他参数根据实验要求进行单因子或多因子设定(如不同菌株、不同培养时间、温度、pH值、培养基含水量的多因子实验,以及无机盐和表面活性剂多因子实验等,具体参数详见各实验组)。
2.2.3. 干燥
将发酵好的物料取出,盛放在培养皿中,40℃干燥箱干燥,干燥后粉碎备用。
2.2.4. 纳豆激酶酶(NK)活测定
1) 纳豆激酶的浸提 取NK发酵干粉0.5 g,加入到10 mL离心管中,用5 mL 0.9%NaCl溶解、混匀后放入4℃冰箱浸提4 h以上。浸提结束后5500 rpm/min离心10 min,移取上清液至干净离心管中4℃临时保存,备用。
2) 血纤维平板的制备 取1支纤维蛋白原(88 mg),加入24.4 ml 0.01M PBS (pH7.4)溶液溶解;凝血酶用灭过菌的0.9% NaCl溶液溶解至100 BP/ml终浓度;1%琼脂糖用0.01M PBS (pH7.4)配置;首先取7.5 ml 1%琼脂糖于无菌小瓶中,50℃保温10 min后,加225 μl 100 BP/ml凝血酶,混匀保温10 min;取纤维蛋白原溶液7.5 ml,缓慢加入琼脂糖(含凝血酶)溶液中并不停摇动;将混匀的溶液倒入灭菌平板中,冷却备用。
3) 标准曲线的绘制 首先绘制标准曲线,取尿激酶标准品用无菌生理盐水稀释成20,40,60,80和100 FU/ml。分别取10 μL点样于融化琼脂糖平板,于37℃保温18 h后,测定血纤维蛋白平板上溶解圈的直径,取两次试验的平均直径计算溶解圈面积。以酶活力(FU/ml)为横坐标,溶解圈面积为纵坐标,得到尿激酶标准曲线,标准曲线的回归方程为y = 1.935x + 53.505,相关系数R2 = 0.9908。
4) 酶活测定 取离心后的上清液1 ml于1.5 ml离心管中,再次离心后取10 uL点样于打好孔的新配制血纤维平板上,置于37℃倒置培养18 h。测定透明圈的大小,计算透明圈面积,从绘制的标准曲线中求得相应的酶活性。
3. 结果与分析
3.1. 鹰嘴豆发酵产NK适宜菌株的筛选
3.1.1. 初筛结果
见表1。
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Table 1. The comparison of NK activity (Fibrin-thrombin Unit/gram, FU/g) between different Bacillus subtilus strains during solid fermentation with Chickpea(Cicer arietinum) media
表1. 不同菌株发酵鹰嘴豆产NK的比较(FU/g)
由表1、图1可知,不同菌株发酵鹰嘴豆产NK的表现差异很大,鹰嘴豆品种对NK的分泌表达也有一定的影响。其中Tx-2、L-1、L2-1、Td-1、D56-3等菌株发酵鹰嘴豆(3个品种综合评估)分泌纳豆激酶的能力较强;菌株L3-1、R-1、R-3、Td-2、Z-2次之;菌株T3-2、Sh2、G-2、Sh7-1、D2-1、D2-3较差。
3.1.2. 复筛结果
将在初筛时产NK能力较强的菌株Tx-2、D56-3、Td-1、L-1等进一步进行发酵培养和重复筛选,实验结果如下。
由表2可见,菌株L-1、Tx-2在鹰嘴豆培养基上产纳豆激酶能力较强和较为稳定,其中菌株L-1的酶活较高。综合初筛和复筛结果,选用菌株L-1开展下面的实验研究。
3.2. 培养时间对鹰嘴豆发酵产NK的影响
鹰嘴豆培养基含水量64%,pH7.0,31℃培养,于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h取样,其他实验条件和方法如上所述,酶活测定结果如下(表3)。
由上表3可知,发酵培养36h时NK活性达到最高;进一步延长培养时间,NK活性没有提高,而且呈缓慢下降趋势;因此,鹰嘴豆发酵产NK的最佳发酵时间为36 h。
3.3. 培养温度对鹰嘴豆发酵产NK的影响
准确称量湿鹰嘴豆50克,121℃,25 min灭菌后接入培养24 h的L-1菌液2 ml,分别放在即25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃培养箱中培养48 h,培养结束后40℃干燥、粉碎、进行酶活测定,结果如下(表4)。
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Figure 1. The comparison of NK activity between different Bacillus subtilus strains during solid fermentation with Chickpea(Cicer arietinum) media (In this figure, the Td-1, L-1 etc. were equivalent to numbers of different strains this experiment used, the same below)
图1. 不同菌株发酵鹰嘴豆产纳豆激酶的比较(图1中的Td-1、L-1等符号对应表1中及正文中的不同菌株的编号)
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Table 2. The secondary screening result for NK activity of different strains with chickpea media
表2. 不同菌株复筛结果
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Table 3. The influence of cultural durations on the NK activity with chickpea medium
表3. 培养时间对NK酶活性的影响
由表4、图2可知,发酵温度对鹰嘴豆固体发酵产纳豆激酶有一定的影响,31℃时酶活性最高,温度过低或过高酶活性均有所下降。因此,确定最佳发酵温度为31℃。
3.4. 培养基含水量对鹰嘴豆发酵产NK的影响
称取鹰嘴豆和蒸馏水,配成不同含水量的培养基(55%,25 g鹰嘴豆 + 25 ml水;64%,20 g鹰嘴豆 + 30 ml水;73%,15 g鹰嘴豆 + 35 ml水;82%,10 g鹰嘴豆 + 40 ml水;91%,5 g鹰嘴豆 + 45 ml水)。4%接种量,31℃培养;其他实验步骤和方法如上所述;酶活测定结果如下(表5)。
由表5可以看出,发酵培养基含水量为64%时酶活性最高,含水量过低或过高酶活性均有所下降。因此,确定最佳含水量为64%~65%左右。
3.5. 培养基pH对鹰嘴豆发酵产NK的影响
用0.2 mol/L Na2HPO4∙12H2O溶液和0.2 mol/L NaH2PO4∙2H2O溶液调整培养基pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;培养基含水量64%,31℃培养箱中培养36 h;其他步骤和方法同上。结果见表6。
由上表可知,培养基pH值为6.0~7.0时酶活性最高,可见,鹰嘴豆发酵产纳豆激酶的适宜培养基pH值为6.0~7.0。
3.6. 添加剂(无机盐及表面活性剂)对鹰嘴豆发酵产NK的影响
在鹰嘴豆培养基添加不同组合的无机盐和表面活性剂溶液(表7),调整培养基pH值至7.0,含水量64%;31℃培养箱中培养36 h;其他步骤和方法同上。实验结果如下(表8)。
由表8可知,鹰嘴豆发酵培养基添加适量的无机盐和表面活性剂对NK的分泌是有利的;适宜配方
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Table 4. The influence of the culture temperatures on the NK activity with chickpea media
表4. 培养温度对NK酶活性的影响
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Table 5. The influence of the medium moisture content on the NK activity (Note: The chickpea moisture content were assumed 10%)
表5. 培养基含水量对NK酶活性的影响
注:干鹰嘴豆含水量按10%计。
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Table 6. The influence of the medium pH values on the NK activity
表6. 培养基pH值对NK酶活性的影响
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Table 7. The experimental combinations design of different inorganic salts and different surfactant (Tween 80) concentra- tions with chickpea media
表7. 不同组合的添加剂(无机盐及表面活性剂)的实验设计
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Table 8. The influence of additive groups (inorganic salts and surfactant Tween80) on the NK activity with chickpea media
表8. 添加剂(无机盐及表面活性剂)对NK酶活性的影响
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Figure 2. The influence of the culture temperatures on the NK activity during solid fermentation with chickpea medium (In this figure, the 25, 28, 31, 34, 37 were consistent one-to-one the culture temperatures 25˚C - 37˚C)
图2. 培养温度对鹰嘴豆发酵产纳豆激酶的影响(图2中的25、28、31、34、37对应表3中的培养温度25℃~37℃)
为A3B2C1D3,即0.06% MgSO4、0.04% CaCl2、0.2% K2HPO4、0.1% KH2PO4和0.1% Tween80。在此组合下,鹰嘴豆发酵产NK的单位酶活可达6731 FU/g。
4. 讨论和结论
自1987年日本学者须见洋行从200余种食物中发现纳豆具有溶栓作用并从中分离纯化到具有强烈溶栓功能的NK(纳豆激酶)以来,近年来科技工作者对纳豆激酶的性质、溶栓机理、吸收方式、以及基因改造、发酵技术等方面进行了大量研究,证明了纳豆激酶是一种有益微生物生命活动过程中产生的丝氨酸蛋白酶;可以口服使用,在人体内半衰期时间达8小时以上,对血管栓斑中的纤维蛋白有选择性溶解效果,能温和持续地提高血液的纤溶活性,不易引起出血,安全系数高,可以发酵生产,非常适合用于溶栓保健制剂的研发。
目前,利用鹰嘴豆发酵产NK的研究还比较少;其中2009年卫拯友等用纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilus Natto)固体发酵鹰嘴豆获得915 FU/g的NK单位酶活;Xuetuan Wei等(2011)用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)固体发酵方法鹰嘴豆获得356.25 FU/g的NK酶活单位;2014年肖萍等以鹰嘴豆培养基和枯草芽孢杆菌(B. subtilus)为基础,对液体发酵产纳豆激酶的实验条件进行了优化研究,获得3210 FU/g的NK单位酶活 [16] [17] [18] 。本研究对鹰嘴豆固体发酵产NK的高产菌株和部分发酵参数进行了初步的实验研究;结果表明,我实验室选育的枯草芽孢杆菌(B. subtilis L−1)是适合鹰嘴豆固体发酵产纳豆激酶的优良菌种;使用B. subtilis L−1菌株,在优化培养基(鹰嘴豆添加适量的无机盐0.06% MgSO4、0.04% CaCl2、0.2% K2HPO4、0.1% KH2PO4和表面活性剂0.1% Tween80)和优化培养条件下(温度31℃,培养基含水量65%,培养基pH 6.0~7.0,发酵时间36h),鹰嘴豆发酵物料中的NK单位酶活可以达到6731 FU/g,远高于文献报道的以鹰嘴豆为原料发酵的NK单位酶活 [18] [19] [20] [21] 。本项目研究为以鹰嘴豆为原料生产高活力NK提供了科学依据,为鹰嘴豆的精深加工和转化增殖提供了一种新途径。
基金项目
河南省科技开放合作项目(142106000201,152106000052);郑州市科技攻关计划项目(141PPTGG415);河南省科技攻关计划项目(152102210167)。