吴茱萸毒性研究

Study on the Toxicity of Fructus Evodiae

摘要: 吴茱萸临床应用广泛，但其毒性在古代本草典籍及药典中均有记载，本篇文章通过查阅吴茱萸毒性研究的相关文献，对其毒性物质基础及作用机制进行整理归纳，为吴茱萸在临床上的安全使用提供参考。

Abstract: Although Fructus Evodiae is frequently used in clinical settings, Chinese pharmacopoeias and An-cient Agrostology Books note that it is hazardous. By reviewing pertinent literature on its toxicity study, this article provides a summary of the poisonous substance base and mechanism of action, as well as references for its safe clinical use.

1. 引言

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸(Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.)、石虎(Evodia rutaecarpa (Juss)，(Benth. var. officinalis (Dode) Huang.)或疏毛吴茱萸(Evodia rutaecarpa (Juss) Benth. var. bodinier (Dode) Huang.)的干燥近成熟果实 [1] 。其性味辛苦，热，有小毒；具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效。可用于厥阴头痛、寒山腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸等症状。现有大量研究显示吴茱萸具有抗炎、抗溃疡、镇痛、止泻、输张血管及降压等药理作用 [2] - [7] 。

但吴茱萸毒性在古代典籍也有记载 [8] ，《神农本草经》中记载，此药味辛、温，有小毒；《本草纲目》曰：“辛，温，有小毒”；权曰：辛、苦，大热，有毒；《名医别录》载“大热，有小毒”；《药性论》云“味苦、辛，大热有毒”；《开宝本草》曰：“味辛、温，大热，有小毒”；《珍珠囊补龙药性赋》言：“味苦、辛，气热，有小毒”；《汤液本草》述：“气热，味辛、苦，气味俱厚，阳中阴也。辛温大热，有小毒”。且吴茱萸临床应用不良反应在近几年也有相应报道 [9] 。有研究发现高剂量的吴茱萸不同提取部位会对大鼠造成不同程度的肝损伤 [10] ，心脏、肾脏等也是吴茱萸毒性的疑似靶器官 [11] ，吴茱萸水煎液氯仿提取部分 [12] 、醇提物 [13] 、挥发油成分 [14] 对肝脏均有损伤，但具体哪些成分对肝脏有毒性作用还需进行深入研究。

2. 吴茱萸致肝毒性

药物性肝损伤为用药时，由于药物本身或药物的代谢产物，或因用药者的特殊体质对药物的超敏感性或者耐受性下降而引起的肝脏损伤。近年来，中药引起肝损伤的关注逐渐增多 [15] [16] [17] [18] ，也有学者发现肝脏是吴茱萸毒性把器官之一 [19] ，李文兰等利用UPLC-Q-TOFMS (超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱)发现吴茱萸碱、吴茱萸次碱、辛弗林、芦丁、绿原酸、柠檬苦素、金丝桃苷等均为是吴茱萸肝毒性部位化学成分及入血成分 [20] ；同时又有研究 [21] 表明以上物质均为吴茱萸水提组分，且都与吴茱萸肝毒性相关性较强；刘舒凌等通过建立吴茱萸水提物指纹图谱并采用灰色关联度分析法及偏最小二乘回归分析法分析了其水提物中27个共有峰与正常人体肝细胞L02的谱–毒关系，发现对肝细胞L02抑制率的灰色关联度分析中的关联度大于0.8、偏最小二乘回归分析中回归系数 > 0且VIP值 > 1重叠的共有峰13个，表明这些峰所指代的化学成分与吴茱萸肝毒性相关性较强，其中峰12、峰9、峰19、峰5、峰17分别为咖啡酸、绿原酸、去氢吴茱萸碱、新绿原酸、金丝桃苷。同时有研究表示吴茱萸各个提取部位均对大鼠的肝脏能造成不同程度的损伤，结果显示五种不同提取部位肝毒性强度为：石油醚部位 > 正丁醇部位 > 水部位 > 氯仿部位 > 乙酸乙酯部位 [10] 。

2.1. 吴茱萸致肝毒性物质基础研究

2.1.1. 生物碱类

生物碱是生物有机体中含有负氧化态氮原子且普遍存在的一种非初级代谢产物，生物碱大多呈碱性，能与酸成盐且多具有显著活性，主要分布于植物界且绝大多数存在于双子叶植物中。生物碱种类繁多，按化学结构分类有：吡啶类、异喹啉类、哌啶类、莨菪烷类、咪哚类生物碱等。

1) 吲哚类生物碱

从吴茱萸中分离得到的吲哚类生物碱包括吴茱萸碱、吴茱萸次碱、二氢吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱及其他化合物10余种，其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱是重要的有效成分 [22] 。

高亚东 [23] 通过研究发现吴茱萸碱具有肝毒性作用，在研究中作者使不同浓度的吴茱萸碱作用于HepG2细胞，CCK-8法(细胞增殖及毒性检测法)用于检测细胞存活率，结果显示吴茱萸碱使HepG2细胞地存活率下降，其之间关系存在着时间和剂量依赖关系。吴茱萸碱是吴茱萸的药理活性成分，推测其也可能是肝毒性成分。在吴茱萸次碱肝肾毒性初步探究实验中，作者使用含有不同浓度吴茱萸次碱的培养液处理HL7702细胞或(与)HEK293细胞，观察吴茱萸次碱对肝肾细胞活力、形态的影响，结果显示吴茱萸次碱对HL7702细胞或HEK293细胞活力具有一定抑制作用，且抑制程度与剂量呈一定依赖性；但细胞形态在倒置显微镜观察下并无明显变化。研究结果最终表明吴茱萸次碱对肝肾具有一定毒性 [24] 。

2) 喹诺酮类生物碱

有学者 [13] 早期在给大鼠灌胃吴茱萸50%乙醇提取物14d观察肝组织病理改变的研究实验中发现，用药组大鼠肝损伤较对照组更明显，后期又利用了超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱(UPLC-Q-TOFMS)法，根据谱效关系，研究发现吴茱萸新碱和二氢吴茱萸新碱为其潜在的肝毒性成分，且二者皆为吴茱萸生物碱种的主要活性成分 [20] 。

2.1.2. 萜类

从吴茱萸中分离出的萜类化合物主要以苦味素为主 [25] 。从吴茱萸中分离得到并且已明确知晓其准确结构的苦味素类化合物均为柠檬苦素类 [26] ，为吴茱萸另一种重要成分。

1) 柠檬苦素

魏舒婷通过大鼠的不同给药方式来讨论吴茱萸不同成分对肝损伤的作用，结果显示吴茱萸碱、吴茱萸次碱腹腔注射比口服给药增加了其体内暴露量，但肝损伤并未增加；柠檬苦素腹腔注射后肝损伤强度明显升高，表示柠檬苦素具有明显肝毒性 [27] 。

2.1.3. 挥发油

吴茱萸富含挥发油成分，其中主要成分为吴茱萸烃和吴茱萸内酯 [26] 。王锐运用自制的“同时蒸馏–萃取”装置提取得到吴茱萸中的挥发油，再利用毛细管气相色谱分离出多种成分 [20] ，通过质谱法检测出其中部分成分，结果显示其中吴茱萸烯相对含量最高 [28] 。同时有研究已经证明吴茱萸挥发油是产生肝毒性的主要物质基础 [29] 。孙蓉 [14] [30] 等用小鼠对挥发油肝毒性“量–时–毒”之间的关系进行了研究，发现吴茱萸挥发油在单次给药剂量为1.35 ml·kg⁻¹时，小鼠肝损伤程度各不相同，在给药8 h小时到达毒性高峰并持续约72 h；肝组织病理学形态检测显示吴茱萸挥发油组分用药8~72 h后，肝组织收到明显损害。该研究提示单次给小鼠灌胃一定剂量的吴茱萸挥发油能引起小鼠急性肝损伤，且肝损伤随着给药时间地延长逐渐恢复，表示具有一定的可逆性；其肝损伤程度存在剂量依赖关系，具有一定的“量–时–毒”关系。同时，黄伟 [14] 对挥发油反复给予灌胃所致肝毒性的研究中发现多次给小鼠灌服一定剂量的吴茱萸挥发油能引起明显的肝损伤，且表现出一定的“量–时–毒”关系。

2.1.4. 黄酮类

吴茱萸中含有的黄酮类成分主要为黄酮及其苷类。芦丁、绿原酸、金丝桃苷、槲皮素等均为吴茱萸水提物中分离鉴定出来的黄酮类化合物 [31] 。刘舒凌等制备了16批不同产地吴茱萸的水提物，再利用超高效液相色谱建立指纹谱图得到27个峰，实验中指认出9种成分，含有黄酮类五种：金丝桃苷(峰17)、芦丁(峰16)、新绿原酸(峰5)、隐绿原酸(峰10)、绿原酸(峰9)；作者采用灰色关联度分析法及偏最小二乘回归分析法结合分析，发现峰17 (金丝桃苷)、峰9 (绿原酸)、峰5 (新绿原酸)等13个峰均为肝毒性相关峰 [17] 。

2.2. 吴茱萸致肝毒性机制研究

吴茱萸致肝损伤机制可能与过氧化损伤、炎性反应因子介导、线粒体损伤、药物–蛋白质加合物的形成等相关 [27] 。

2.2.1. 过氧化损伤

在正常生理状况下，动物体在代谢过程中会产生活性氧自由基，可被活性氧体系所清除，以维持体内氧化与抗氧化反应之间的动态平衡 [32] 。当体内自由基生成较多或者活性氧清除剂(如SOD<超氧化物歧化酶>、GSH<谷胱甘肽>等)活性有所下降时，自由基便可以和生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的不饱和脂肪酸等大分子物质发生过氧化反应，致使体内氧化物含量上升，如丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)，形成细胞的过氧化损伤 [33] 。

吴茱萸水提物和挥发油均可使小鼠血中和肝组织内MDA、NO (一氧化氮)、NOS (一氧化氮合酶)含量增加，同时SOD、GSH和GSH-Px (谷胱甘肽过氧化酶)活性下降，提示吴茱萸导致肝损伤的途径与脂质过氧化有关 [34] [35] [36] 。

2.2.2. 炎症反应

炎症反应实质是机体与制炎因子进行抗争的反应。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-1β (IL-1β)、白介素-6 (IL-6)等都是参与炎症反应的细胞因子–即炎症因子。AST多存在于肝细胞的线粒体中，肝细胞损伤导致肝细胞膜的通透性增加，细胞内AST便可进入血液当中，血清中AST含量会升高；ALT主要存在于多种细胞当中，特别是肝细胞内ALT浓度比血清中水平高的1000~3000倍，所以当肝细胞受损时血清中其含量明显升高 [32] 。但AST与ALT均缺乏特异性，AST及ALT均为肝功能检查中的重要项目，均可作为肝组织受损的标志，但不能作为特异性指标 [37] 。

周璐等通过研究不同剂量吴茱萸水煎液对小鼠肝脏损害的毒性机制发现高剂量吴茱萸引起血清ALT、AST显著增高，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高；提示其引起肝毒性的机理与炎症因子生成和释放有关 [28] 。通过对不同吴茱萸炮制品肝毒性影响的比较研究，刘舒凌发现生吴茱萸、甘草制吴茱萸及盐制吴茱萸对TNF-α、IL-1β均有一定的促进作用，TNF-α、IL-1β的水平均显著升高 [38] 。廖文强 [39] 等用吴茱萸水提物和醇提物连续灌胃小鼠15d后，发现吴茱萸水提物和醇提物均可致小鼠肝脏磷酸化Erk1/2表达量显著上调，活化Erk1/2可诱导细胞可产生TNF-α。通过以上研究均可发现，吴茱萸肝毒性或与炎症反应因子的产生有关。

2.2.3. 线粒体损伤

吴茱萸水提物显著降低ATP含量和线粒体膜电位，增加肝脏线粒体膜通透性，使细胞色素C进入细胞质数量增加，电镜下观察线粒体发生肿胀，其空泡样变面积增大，说明吴茱萸水提物对线粒体有明显的影响 [40] 。在Cai Q的研究中，他们通过口服吴茱萸水提液15天，从大鼠肝脏中分离线粒体，研究了吴茱萸诱导氧化应激和线粒体通透性转化(MPT)的能力。试验最终表明，吴茱萸水提液可诱导大鼠线粒体氧化损伤，导致线粒体肿胀、空泡化、MPT孔洞打开、线粒体电位降低，说明吴茱萸诱导MPT，最终导致ATP耗竭和CytC释放，触发细胞死亡信号通路 [41] 。

2.2.4. 药物–蛋白质加合物的形成

活性代谢物(RMs)在药物性肝损伤中起着重要作用，吴茱萸中所含化学成分吴茱萸次碱具有仲胺结构，可被激活为RMs。吴茱萸碱很容易被氧化成环氧结构与GSH结合，如果GSH被消耗殆尽，可能会产生一定的肝损伤 [42] 。且已经有研究报道具有仲胺结构的化学物质在代谢时会产生RMs，引起药物性肝损伤 [43] 。

3. 吴茱萸致肾毒性

3.1. 吴茱萸致肾毒性物质基础研究

生物碱

周倩等 [44] 采用MTT法检测吴茱萸中4种组分对人胚肾细胞(HEK-293)体外活性的影响，以及利用倒置相差显微镜观察给药后的细胞形态。结果发现给予不同浓度吴茱萸碱、吴茱萸次碱，其对肾细胞活力都具有不同程度的降低作用，且用量越高，细胞活力降低愈明显；辛弗林在给药后细胞活力并未见明显变化。肾细胞在给予不同浓度吴茱萸碱之后，肾细胞不同程度减少，细胞形态发生大量变圆发亮、死亡等变化；但在给药吴茱萸次碱及辛弗林之后肾细胞形态并未发生明显变化。即表示吴茱萸碱和吴茱萸次碱对人胚肾细胞有一定毒性，但辛弗林暂未显示出肾细胞毒性。张茜等 [24] 也使用人正常肝细胞(HL7702)、人胚胎肾细胞(HEK293)在吴茱萸次碱对肝肾毒性的初步研究中发现大剂量的吴茱萸次碱对在肝、肾部位均有不同的毒性作用。

3.2. 吴茱萸致肾毒性机制研究

左金丸中潜在肾毒性成分的发现及其机制研究中，作用利用体内实验发现：① 吴茱萸碱诱导肾细胞死亡可能是通过诱导细胞内钙离子超载调控P13K/AKT/mTOR相关通路实现的；② 吴茱萸碱可能通过影响机体代谢相关途径，该研究通过对吴茱萸碱处理后的小鼠血浆代谢组学分析发现，小鼠血浆中的醛固酮通路中皮质醇和可的松的含量显著降低，表明吴茱萸处理后对小鼠体内糖皮质类激素代谢水平有明显作用。上述研究发现表明吴茱萸引起的肾损伤，可能与其能够诱导细胞凋亡Bax和Bcl-2的相关蛋白表达有关 [45] 。

4. 吴茱萸致心脏毒性

4.1. 吴茱萸致心脏毒性物质基础研究

有研究 [11] 通过大鼠经口重复给药吴茱萸醇提物，判定毒性靶器官，大鼠器官解剖经电镜检查显示，高剂量组大鼠心脏病变较重，心肌细胞肌丝紊乱、内质网扩张、线粒体肿胀，且恢复期无明显好转；中低剂量组无异常，但恢复期病变加重。实验结果显示心脏为可疑靶器官。邓银华 [46] 通过体内和体外实验了探讨吴茱萸碱对心脏的毒性，实验结果显示一定浓度的吴茱萸碱能够降低心肌细胞的生存活力。实验同时利用斑马鱼进行体内实验，观察了吴茱萸碱对其心脏细胞形态、心率及心律的影响。在体和离体试验最后得到结果：本研究结果表明，暴露于354 ng·ml⁻¹吴茱萸碱24 h可导致显著的心脏毒性，暴露于38 ng·ml⁻¹时即可影响心脏发育，吴茱萸碱对心脏具有一定的毒性。

4.2. 吴茱萸致心脏毒性机制研究

同时邓银华 [46] 在上述研究中还发现，吴茱萸碱可导致MDA水平和SOD活性降低，即预示着吴茱萸碱的心脏毒性与氧化应激损伤有极大相关性。用MDA含量评价脂质过氧化程度，并以SOD为主要的抗氧化酶，在细胞对抗ROS所致细胞损伤起着重要的作用，上述研究结果显示，心肌细胞于浓度为31.3~250 μg·ml⁻¹的吴茱萸碱中暴露24 h后，MDA含量和SOD活性均显著降低，心肌细胞受到氧化应激损伤。

5. 吴茱萸致遗传毒性

吴茱萸致遗传毒性物质基础研究

国内吴茱萸遗传毒性研究研究相对较少，仅有杨秀伟等 [47] 利用Ames试验、小鼠精子畸变试验及小鼠骨髓细胞微核实验，对吴茱萸水提物和70%乙醇提取物急性毒性及致突变性进行了研究，发现其并不具有遗传毒性。

后夏祺悦等 [48] 选择使用Ames试验、体外CHL细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，对吴茱萸及其重要组分吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的遗传毒性进行了研究，发现在此次实验条件下吴茱萸醇提物不具有遗传毒性。但在体外试验中，吴茱萸次碱和柠檬苦素有致突变性。而产生以上差异的原因作者认为有以下三种情况：① 体内外试验生物系统、代谢途径等的差异：活性代谢产物能于体内快速且高效地解毒，但在体外却不能；受试物在体内能快速并且高效地被排出体外。② 该实验体外采用的主要成分给药，而体内采用的吴茱萸醇提物给药，且药物经口服给药，生物利用度低，则体内试验中主要成分含量相对体外实验较低，并未达到最高微核试验的最高剂量要求，实际的血药浓度和到达靶组织的浓度达不到体外的给药浓度。③ 吴茱萸醇提物各个组分直接可能通过其相互作用降低了毒性。

6. 结语

中药毒性一直是中药临床用药及中药制剂持续关注的问题。吴茱萸历史悠久，药理作用广泛，其毒性也在古代本草经典著作中有所记载，本篇文章对吴茱萸引起肝毒性、肾毒性、心脏毒性及遗传毒性物质基础及作用机制进行了总结概括，对吴茱萸安全用药具有一定积极作用。但其神经性毒性及遗传毒性机制国内外研究较少，有待进行进一步深入研究。