1. 引言
魔芋为天南星科多年生的块茎草本植物 [1] [2] ,广泛分布于陕西、甘肃、四川、云南、贵州、宁夏至江南等地 [3] 。魔芋多糖是魔芋最重要的活性成分,含量高达55%~80% [4] ,具有减肥、抗病毒、降低血糖 [5] 、降血压 [6] [7] 等功效,可以治疗习惯性便秘,防治肠癌、食道癌 [8] 。但血液的高甘油三脂对高血糖有明显抑制作用 [9] ,在食品工业领域、生物医学领域具有广泛的应用前景 [10] 。
目前常用的多糖提取的方法包括微波辅助提取法、水提醇沉法、超临界流体萃取法、索氏抽提法、酶辅助提取法、酸提取法、碱提取法、超声波辅助提取法等 [11] [12] [13] [14] [15] 。其中,超声波辅助提取法具有安全性好、操作简便、提取率高、节省时间、能耗低等优点 [16] [17] [18] 。因此,本研究以魔芋为原料,通过超声波辅助提取魔芋中多糖,将料液比、超声功率、温度、超声处理时间作为4个考察因素,然后利用正交试验优化魔芋多糖的提取工艺,在此条件下得到最适宜的提取工艺条件,为魔芋多糖的开发利用提供理论依据。
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
DK-98-IIA型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);FA1104型电子天平(上海精科);T6新世纪型紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司);KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
魔芋粉由丹凤县凯农魔芋精粉有限公司提供。苯酚、浓硫酸、D-无水葡萄糖均为分析纯。
2.2. 实验方法
2.2.1. 魔芋多糖的提取
通过超声波辅助水提法提取魔芋总多糖,把魔芋粉放入水中搅拌均匀,引入超声波辅助提取,经过超声后所得到的溶液进行抽滤除杂,然后将所得的水溶液进行浓缩,浓缩到原体积的1/2,将浓缩液放到100 mL的容量瓶中定容,即得到魔芋总多糖的提取液 [19] 。
2.2.2. 葡萄糖标准曲线的绘制
精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg置于100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至容量瓶刻度处,得到葡萄糖对照品溶液(0.1 mg/mL)。各精密移取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖对照品溶液到25 mL具塞试管中,随后添加蒸馏水,使其每个试管都补足至2 mL,加1 mL 5%苯酚溶液,将其在旋涡混合器上混匀,小心加入10 mL浓硫酸,在旋涡混合器上小心混匀,然后放入水浴锅中,在沸水中停留2 min,随后拿出来冷却到室温,用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度,并制备空白对照。绘制葡萄糖标准曲线,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标。
2.2.3. 魔芋多糖提取率的计算
(1)
式中:C——魔芋总多糖的质量浓度,mg/mL;N——稀释倍数;V——魔芋总多糖提取液定容的体积,mL;M——魔芋干粉的质量,g。
2.2.4. 单因素试验
采用超声波辅助提取魔芋多糖的工艺方法,以料液比(1:200、1:250、1:300、1:350、1:400 g/mL)、超声温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)、超声时间(1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)、超声功率(20 W、40 W、60 W、80 W、100 W)作为单因素,把魔芋多糖提取率作为评价指标,进行魔芋多糖提取的单因素试验。
2.3. 方法学考察
2.3.1. 精密度试验
精密移取1 mL葡萄糖对照品溶液到25 mL具塞试管中,随后添加蒸馏水,将所移取的葡萄糖对照品溶液补充到2 mL,并加1 mL 5%苯酚溶液,振摇,随后加入10 mL浓硫酸,振摇,缓慢冷却至室温,于490 nm处测吸光度,同时制备空白对照。平行测定6次,计算其RSD值。
2.3.2. 稳定性试验
精密称取魔芋粉末1 g,按照最佳工艺提取,得到魔芋多糖的待测液,用移液管移取2 mL于50 mL容量瓶中加蒸馏水定容,然后吸取容量瓶溶液2 mL,将其放到25 mL具塞试管中,并加入1 mL 5%苯酚溶液、浓硫酸10 mL,摇匀,静置冷却至室温。空白溶液为2 mL蒸馏水、1 mL 5%苯酚溶液与10 mL浓硫酸的混合溶液,显色完成后立即测定吸光值,并分别在0、30、60、90、120、150 min测定吸光度,计算其RSD值。
2.3.3. 重复性试验
精密取称魔芋干燥粉末1 g,6份,精密称定,按照最佳工艺提取,得到魔芋多糖的待测液,用移液管各移取魔芋多糖的待测液2 mL于6个50 mL容量瓶中加蒸馏水定容,然后分别吸取容量瓶溶液2 mL,放到25 mL具塞试管中,各加入1 mL 5%苯酚溶液、浓硫酸10 mL,摇匀,静置冷却至室温。空白溶液为2 mL蒸馏水、1 mL 5%苯酚溶液与10 mL浓硫酸的混合溶液,显色完成后立即测定吸光值,计算其RSD值。
2.3.4. 加样回收率
精密称取已知含量的魔芋干燥粉末1 g,共6份,按照最佳工艺提取,得到魔芋粉多糖待测液,取该待测液1 mL于具塞试管中,再加入0.1 mg/mL葡萄糖标准液1 mL,加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸10 mL,摇匀,静置冷却至室温。空白溶液为2 mL蒸馏水、1 mL 5%苯酚溶液与10 mL浓硫酸的混合溶液,显色完成后立即测定吸光值,计算平均加样回收率和RSD值。
3. 结果与讨论
3.1. 葡萄糖标准曲线
线性回归方程为:y = 4.7593x − 0.0007,R2 = 0.9998,式中:x为葡萄糖的浓度,mg/mL;y为吸光度,A;如图1所示。
结果表明,葡萄糖在线性范围在0~0.12 (mg/mL)的浓度内与吸光度有良好的线性关系。
3.2. 单因素试验结果
3.2.1. 料液比对总多糖提取效果的影响
![](//html.hanspub.org/file/15-2182057x9_hanspub.png?20230630101643601)
Figure 2. Effect of material liquid ratio on the extraction rate of total polysaccharides from konjac
图2. 料液比对魔芋总多糖提取率的影响
由图2中可知,料液比在1:200 (g/mL)~1:400 (g/mL)之间,随着料液比的增加,魔芋多糖的提取率也在增加,但料液比在1:300 (g/mL)时,魔芋多糖提取率最高,随后魔芋多糖的提取率呈下降趋势。其原因是随着料液比的增大,溶剂用量也会随之增加,魔芋多糖的浸出率也会增大,但当溶剂用量增加到一定值时,溶剂把超声波辐射大量吸收,从而溶剂溶解杂质也增多,以至于不能完全作用于样品。因此,选取料液比1:250、1:300、1:350 (g/mL)进行正交试验。
3.2.2. 提取温度对总多糖提取效果的影响
![](//html.hanspub.org/file/15-2182057x10_hanspub.png?20230630101643601)
Figure 3. Effect of temperature on the extraction rate of total polysaccharides from konjac
图3. 温度对魔芋总多糖提取率的影响
由图3所示,随着温度的增大,魔芋多糖的提取率在逐渐增大,温度为40℃时,魔芋多糖提取率达到最大值。但当超过40℃时,随着温度的持续升高,魔芋多糖提取率也随之下降,其主要原因是随着温度的升高,分子的运动速度加快,魔芋多糖会很容易从细胞中转移到溶质中,但是温度过高,会把一部分多糖化合物很容易的氧化破坏,以至于产生杂质,不利于后期的分离。所以,选取35℃、40℃、45℃进行正交试验。
3.2.3. 超声处理时间对总多糖提取效果的影响
![](//html.hanspub.org/file/15-2182057x11_hanspub.png?20230630101643601)
Figure 4. Effect of ultrasound treatment time on the extraction rate of total polysaccharides from konjac
图4. 超声处理时间对魔芋总多糖提取率的影响
由图4可知,随着超声处理时间的增长,魔芋多糖提取率在2 h的时候达到最大值,但超声处理时间超过2 h时,魔芋多糖的提取率明显下降,可能是因为时间过长,破坏了魔芋多糖的结构。所以,选取1.5 h、2 h、2.5 h进行正交试验。
3.2.4. 超声功率对总多糖提取效果的影响
![](//html.hanspub.org/file/15-2182057x12_hanspub.png?20230630101643601)
Figure 5. Effect of ultrasound power on the extraction rate of total polysaccharides from konjac
图5. 超声功率对魔芋总多糖提取率的影响
由图5可知,随着超声功率的增加,魔芋总多糖的提取率先升高后下降,在60 W的时候达到最大值,当超声功率继续增加时,魔芋多糖提取率出现下降的趋势。其主要原因是魔芋细胞的破壁程度逐渐增加,使魔芋中多糖溶出增多而使提取率升高,但当超声功率超过60 W的时候,由于超声功率的持续增大,超声波的破碎效应也在逐渐增大,会使魔芋中大量的杂质浸出,从而导致多糖的提取率下降。所以,选40 W、60 W、80 W进行正交试验。
3.3. 正交试验
选择料液比(A)、温度(B)、超声时间(C)、超声功率(D)作为正交试验的4个因素,每个因素设计考察3个水平,研究其对魔芋中多糖提取率的影响,设计L9(34)正交试验因素水平表,试验中魔芋多糖因素水平选取见表1,试验设计结果如表2所示。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 1. Orthogonal design factor level table
表1. 正交设计因素水平表
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. Results of orthogonal experiment
表2. 正交试验结果
通过表1和表2中的魔芋多糖正交试验结果可知,各因素对魔芋多糖提取率影响的主次顺序为:A > D > B > C,最佳的提取工艺参数是A3B3C2D2,魔芋多糖提取率最佳条件是料液比1:350 (g/mL),温度45℃,超声时间2 h,超声功率60 W。
3.4. 验证试验
为验证正交试验结果,料液比1:350 (g/mL),温度45℃,超声时间为2 h,超声功率为60 W。精密称取1 g魔芋粉在魔芋多糖提取适宜工艺条件下进行试验,重复测3次,试验结果如表3所示。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 3. Results of confirmatory tests
表3. 验证性试验结果
由表3可知,魔芋多糖提取率求其平均值为4.79%,RSD值为0.77%,表示该超声辅助提取魔芋多糖的工艺参数准确可靠,结果重现性较好。
3.5. 方法学考察
由表4可知:精密度试验:RSD = 1.22% (n = 6),说明仪器的精密度良好。
稳定性试验:RSD = 1.78% (n = 6),说明魔芋多糖样品溶液中的多糖在150 min内稳定性良好。
重复性试验:RSD = 1.62% (n = 6),说明该方法重复性良好。
加样回收试验:魔芋多糖的平均加样回收率为97.7%,RSD = 1.55% (n = 6)。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 4. Results of methodological evaluation
表4. 方法学考察结果
4. 结论
本实验对魔芋总多糖提取工艺进行了优化,优化的提取工艺参数为料液比1:350 (g/mL),温度45℃,超声时间为2 h,超声功率为60 W。在此条件下,魔芋多糖提取率为4.57%,且在方法学考察中,其RSD值均在合格范围内,表明采用超声波辅助提取工艺简单、稳定可行,为魔芋多糖生产工艺和质量控制提供了科学依据。
基金项目
陕西省大学生创新创业训练计划项目(S202011396086);丹凤县凯农魔芋精粉有限公司专项科研基金项目(2018HXKY013);商洛市科技计划项目(2022-Z-0001);商洛学院科研基金项目(19SCX05)。