1. 引言
中国银杏资源丰富，占世界70%；其全身是宝，提高资源的深加工水平是该领域研发热点之一。国内外对银杏的开发利用以银杏叶和白果(银杏种仁)为主。白果是一种营养丰富、药食兼备的天然资源。白果粉是白果加工而成的产品，具有保健作用和独特的风味，深受消费者的喜爱，用白果粉冲剂可制成具有保健作用的银杏粉冲剂 [1] [2] 。史垠垠等研究以白果为原料生产的饮料是营养价值很高的果味饮品，不仅有着独特的风味，而且有补心养气，益肾润肺，涩精固元，延年益寿，止咳平喘等功效 [3] 。同时以银杏果为主料，配以玉米粉、脱脂奶粉等为辅料制成营养丰富、易吸收的早餐粉 [4] 。
银杏酚酸类物质存在于白果、银杏外种皮和银杏叶中，是银杏及其制品中具有重要生物活性的成分。银杏酚酸属漆酚类物质，具有杀虫、杀菌和抑菌作用 [5] [6] ，也有研究表明，银杏酚酸类物质具有细胞毒性、非免疫毒性、引起变态反应、以及诱导有机体突变和致癌的可能性 [7] [8] [9] 。Lepoittevin等通过豚鼠的过敏试验也发现了银杏酚酸是主要的过敏原 [10] 。银杏酚酸类物质的毒性包括胚胎毒性、致突变毒性和肾毒性等；如将银杏酸置于小鸡胚中进行试验，其胚胎毒性较强；若银杏提取物含16%银杏酸，半数致死量可为1.8 mg/只。银杏酸在大鼠的原代肝细胞中，能够致使DNA双链断裂，具有潜在的致突变毒性 [11] 。银杏酚酸作为银杏药物、提取物及半成品质量标准的重要控制指标之一，受到人们的广泛关注。目前国际生产标准，要求必须将银杏酸含量控制在5 ppm以下。2020版中国药典标准规定：用HPLC法检测，GBE中总银杏酸不得超过5 ppm [12] 。
银杏酚酸难溶于水和乙醇，易溶于石油醚等非极性溶剂，属于脂溶性化合物。在紫外线光照射过程中会出现强烈的淡蓝色荧光反应，为银杏酚酸的紫外吸收特性。银杏酚酸的酸性可以在皂化反应中酸碱中和，易于银杏酚酸的萃取分离，但是副产物较多。由于银杏酚酸羧基的存在，在200℃的条件下，银杏酚酸苯环上的羧基发生脱羧反应，表现出其热不稳定的性质，可利用这种性质特点，对银杏酚酸进行高温处理，从而达到去除部分银杏酚酸的目的 [7] 。考虑到溶剂法操作简单、脱除银杏酚酸较为彻底，为确保银杏酚酸含量在标准范围之内，预防白果粉安全隐患，本文拟采用复合溶剂法进行脱银杏酚酸的工艺研究，以制作一种稳定性良好、营养健康、具有保健功效的低银杏酚酸白果粉。
2. 材料与仪器设备
主要材料：市售银杏果：色谱纯乙腈(南京盛庆和化工)，色谱纯甲醇、正己烷、无水乙醇(国药集团化学试剂公司)。
主要仪器设备：1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；BSA124S分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；FD-1冷冻干燥机，北京博医康技术公司。
3. 实验方法
3.1. 工艺流程
原料→初选→蒸煮→脱壳→研磨→脱酸→筛分→包装
操作要点：
1) 初选：将新鲜的白果用水选法除去霉烂和空心果，用40℃的风箱烘干直至其质量不会下降。
2) 蒸煮：先用开水煮沸20~30分钟，以1:3的比例将白果和水的比例煮沸，同时搅拌，以去除白果表皮上的银杏酸和其他有害物质。经预煮后，果皮的某些部位发生了裂痕，使果肉与果皮分离。
3) 脱壳：把水份排出，然后把它去掉。去皮及核：用清水反复冲刷，去掉内皮，取出内心。果芯中银杏酚酸的含量一般为核桃的200~500倍，去掉果核后，银杏果实的毒性物质含量明显下降。
4) 研磨：用胶体研磨机把水和白果仁按一定的比例加到一起，然后研磨均匀，然后在实验室里用小型药剂研磨机研磨，然后用120目筛分，存放在阴凉、干燥的地方。
5) 脱酸：采用正己烷–乙醇水洗脱：采用正己烷–乙醇溶液洗脱去残余的银杏酚酸，并分别测定了正己烷浓度、洗脱振荡频率、温度、时间和反应面法。
6) 筛分：用分选机对颗粒大小和大小适宜的全白果粉进行筛分。
7) 包装：将白果粉末定量称重后，按盒自动打包。
3.2. 白果粉中银杏酚酸含量的检测方法
以中国药典2020中银杏叶浸膏中的酚酸为主要成分，使用HPLC法测定其含量 [13] 。总银杏酸参照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150 mm，柱内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以含0.1%三氟乙酸的乙腈为流动相A，含0.1%三氟乙酸的水为流动相B，梯度洗脱；检测波长为310 nm。
对照品溶液的制备：取白果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1 μg的溶液，作为对照品溶液；另取总银杏酸对照品适量，用甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作为定位用对照溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末约0.500 g，精密称定，置具离心管中，精密加入甲醇5 mL，称定重量，超声使其溶解，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各50 μL，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。根据白果酸(C15:1)标品(纯度90%)做出标准曲线(如图1所示)，使用最小二乘法进行线性回归得Y = 9.8692X − 0.5249，R2 = 0.9996，表明线性关系良好，总银杏酚酸含量可用白果酸含量乘以其对应的比例系数得到。白果酸的标准品HPLC图如图2所示。
3.3. 实验设计
3.3.1. 脱酸单因素试验设计
根据相似相容原理，采用正己烷–乙醇溶液进行提取。精准称取0.500 g白果粉于10 mL离心管中，加入4 mL一定比例的正己烷–乙醇溶液，在一定条件下水浴震荡一定时间，在3500 r/min转速下下离心10 min，回收有机溶剂，真空冷冻干燥后，用甲醇超声提取去酸后的白果粉，使用高效液相色谱仪检测其银杏酚酸含量 [14] 。
Figure 1. Standard curve of ginkgolic acid
图1. 白果酸标准曲线图
注：5 min之前出的色谱峰为溶剂峰，后续34.478 min处为白果酸(C15:1)，37.106 min处为类似物氢化白果酸(C15:0)、38.490 min处为类似物白果新酸(C17:1)。
Figure 2. HPLC chromatogram of total ginkgolic acid in the sample
图2. 样品总银杏酚酸HPLC色谱图
对正己烷浓度、洗脱温度、振荡频率、洗脱时间4个因素检测其脱酸作用；设定温度 = 30℃，震荡频率 = 120 r/min，时间 = 20 min，分别使用浓度为5%，10%，15%，20%，25%的正己烷溶液洗脱，检测银杏酚酸含量，选取最优浓度水平；设定温度 = 30℃，震荡频率 = 120 r/min，浓度为最优水平，分别选取10、20、30、40、50 min的时间进行洗脱，检测结果，选取最优时间水平；控制其他条件一致，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行洗脱，检测结果，选取最优温度水平；控制其他条件一致，分别在80、100、120、140、160 r/min的振动频率下进行洗脱，检测结果，选择最优振动频率水平。从单因素实验中选择显著(P < 0.05)的因素，在最佳结果对应水平左右均匀选出3个水平，为后续响应面试验铺垫 [9] 。
3.3.2. 脱酸响应面试验设计
在单因素试验的基础上，选取对感官评分影响显著的3个因素，利用Box-Behnken试验设计与分析进行3因素3水平响应面优化。
4. 实验结果
4.1. 溶液中正己烷含量对降低酚酸含量的影响
先固定其他变量，洗脱温度为40℃，振动频率为120 r/min，洗脱时间为30 min，分别加入正己烷浓度在5%、10%、15%、20%、25%的正己烷–乙醇溶液，进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。
Figure 3. Effect of n-hexane concentration on the content of ginkgolic acid
图3. 正己烷浓度对银杏酚酸含量的影响
通过单因素方差分析，如图3所示，淀粉浆浓度该因素的P < 0.01，即对结果非常显著，如图所示，在正己烷浓度从5%到15%，银杏酚酸含量逐渐减少，白果酸的极性跟接近于正己烷，并且白果酸占总银杏酚酸比例较高，故总酸含量显著降低，在浓度为15%酚酸含量降至最低；从15%~25%，由于白果粉中部分金属离子与乙醇和正己烷逐渐形成了配位化合物，正己烷的相对浓度反而下降，拟优选10%~20%范围进行后续优化。
4.2. 振动频率对降低酚酸含量的影响
先固定其他变量，洗脱温度为40℃，正己烷浓度为15%，洗脱时间为30 min，分别设置卧式振荡床转速在80、100、120、140、160 r/min，进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。
通过单因素方差分析，如图4所示，振动频率浓度该因素的P > 0.05，即对结果不显著，振荡频率的快慢一定程度上可以改变提取的速率，然而一方面由于酚酸含量较低容易提取，一方面是在其他提取条件，如温度和正己烷浓度的影响远超振动频率的影响；根据低能效原则，在影响不显著的情况下，可以不选择进行后续优化实验。
Figure 4. Effect of vibration frequency on the content of ginkgolic acid
图4. 振动频率对银杏酚酸含量的影响
4.3. 洗脱温度对降低酚酸含量的影响
先固定其他变量，振动频率为80 r/min，正己烷浓度为15%，洗脱时间为30 min，分别设置卧式振荡床保持恒温在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。
通过单因素方差分析，如图5所示，洗脱温度该因素的P < 0.01，即对结果非常显著；在洗脱温度从30℃到40℃，银杏酚酸含量逐渐减少，正常大气压下，正己烷在乙醇内的最适溶解温度为33℃，而在封闭环境下气压高于外界大气压，最适溶解温度有所上升，故提取效果变好；从40℃到70℃，由于乙醇逐渐接近沸点，正己烷的溶解性下降导致洗脱效果下降，拟优选30℃到50℃范围进行后续优化。
Figure 5. Effect of elution temperature on the content of ginkgolic acid
图5. 洗脱温度对银杏酚酸含量的影响
4.4. 洗脱时间对降低酚酸含量的影响
先控制其他变量一致，振动频率为80 r/min，正己烷浓度为15%，洗脱温度为40℃，分别设置洗脱的时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。
Figure 6. Effect of elution time on the content of ginkgolic acid
图6. 洗脱时间对银杏酚酸含量的影响
通过单因素方差分析，如图6所示，洗脱时间该因素的P < 0.05，即对结果显著，洗脱时间的长短一定程度上可以改变提取的总量，由于在一定时间后达到提取饱和故提取量不再增加，拟优选20~40 min范围进行后续优化。
4.5. Box-Behnken试验结果与分析
在单因素试验的基础上，以银杏酚酸含量(Y)为响应值，以对影响显著的3个因素正己烷浓度(A)、洗脱温度(B)和洗脱时间(C)为考察因素，Box-Behnken试验结果与分析见表1。
Table 1. Optimization of removing ginkgolic acid technology parameters by Box-Behnken
表1. Box-Behnken法优化脱银杏酚酸参数
运用Design expert里面的软件对表3.3中得分进行拟合，得回归方程：Y = 2.83 − 1.31*A − 0.3513*B − 0.425*C − 0.1650*AB + 0.5625AC + 0.2475BC + 2.12A2 + 2.29B2 + 0.8500C2，将上述回归方程进行方差分析，结果如表2所示。
Table 2. Analysis of variance of response surface test results
表2. 响应面试验结果方差分析
注：“*”表示对结果影响显著(P < 0.05)；“**”表示对结果影响极显著(P < 0.01)。
由表2可知，所建立模型的P < 0.001显著；失拟项P > 0.05，不显著，表明模型具有较高可靠性；调整决定系数RAaj = 0.9865表明银杏酚酸含量的变化有98.65%来源于正己烷浓度、洗脱温度和洗脱时间；信噪比(signal-to-noise, S/N) = 32.81 > 4，也从另一个方面表明此模型是可靠的。经方差分析，3个因素对降低银杏酚酸含量影响的主次顺序为A > B > C，即正己烷浓度 > 洗脱温度 > 洗脱时间。
利用Design Expert 8.0.5软件对所得的回归方程进行逐步回归，确定最佳工艺参数正己烷含量为16.69%，洗脱温度为41.73℃，洗脱时间为28.02 min，此时银杏酚酸的含量预测值为2.29 mg/kg，小于规定的5 mg/kg，可以采用。为了便于实际操作，将最佳工艺参数修订为正己烷含量17%、洗脱温度42℃、洗脱时间30 min，在此最优条件下，银杏酚酸的总含量为2.31 mg/kg，与模型预测值(2.25 mg/kg)较一致，验证了模型的可靠性。
5. 结论
本文主要对白果粉中银杏酚酸进行脱除实验工艺参数优化，主要采用正己烷–乙醇混合溶液洗脱法进行实用化工艺尝试，获得如下结果或结论：
1) 通过预蒸煮、复合型有机“绿色”溶剂洗脱，可有效降低白果粉中银杏酚酸含量；
2) 采用响应面法获得较优条件，为满足实际生产应用，再进行工艺参数的整数修订，具体结果如下：正己烷含量17%、洗脱温度42℃、洗脱时间30 min，在此最优条件下，银杏酚酸的总含量为2.31 mg/kg；
3) 利用最优工艺参数，制备的实验样品，完全符合国家药典2020版标准对酚酸含量的限定要求，满足制药标准。
基金项目
江苏省科技项目(苏北科技专项) (编号XZ-SZ202133)、佛山市科技创新专项资金(2015IT100015)。
NOTES
*通讯作者。