1. 引言
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种慢性进行性神经退行性疾病,是最常见的老年痴呆类型 [1]。AD的发病机制目前尚未完全阐明。
随着先进的全基因组和转录组等测序技术的发展,越来越清楚的是,人类基因组的80%被转录为非编码RNA (ncRNAs),在细胞中行使必要的功能 [2]。ncRNA是一个庞大而多样的非蛋白编码转录物家族,通过许多不同的机制控制基因表达程序来调节细胞功能。实验证明与AD相关的ncRNA包括circular RNA (circRNA)、long non-coding RNA (lncRNA)、microRNA (miRNA)等。
竞争性内源RNA (competing endogenous, ceRNA)是一种能够竞争结合RNA的作用元件,通常lncRNA和circRNA会竞争结合miRNA。ceRNA调控网络中包括四种RNA,即mRNA、miRNA、circRNA和lncRNA,其中miRNA处于调控的核心地位。
MiRNA是一类单链RNA分子,研究表明,miRNA与突触功能和记忆形成过程中的特定信号密切相关 [3] [4]。miRNA作为一个转录后调控的重要因子,其活性可被lncRNA通过“海绵”吸附的方式调控。lncRNA已被证实参与AD疾病中β淀粉酶的生成、突触损伤、神经营养因子的丢失、炎症、线粒体功能障碍、氧化应激等多种过程 [5] [6] [7]。
circRNA可以通过吸附miRNA、与mRNA结合蛋白相互作用或调节转录来调控基因的表达,甚至可以翻译产生多肽。最近的报告显示,circRNA在AD等神经退行性疾病的发展中起着重要作用 [8]。
越来越多的研究发现ncRNAs与AD发病机制有关 [9],尽管如此,与AD相关的ceRNA调控网络研究较少见,本文对ceRNA调控网络与AD发病机制的关系进行系统的挖掘,深入探讨ceRNA调控网络与AD疾病发病机制的潜在关系,为临床治疗提供基础。
2. 材料与方法
2.1. 材料
通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台的基因表达综合数据库GEO (Gene Expression Omnibus),在人类物种下以“Alzheimer’s disease”为关键词寻找相关数据芯片,分别检索有关mRNA和miRNA的原始数据。本项目下载mRNA表达谱GSE18309 (下载日期:2021/07/18)和miRNA表达谱GSE120584 (下载日期:2021/07/18)进行后续数据分析。
2.2. 差异表达分析
利用GEO数据库自带的交互式线上分析工具GEO2R对GSE18309 (3个AD样本和3个正常样本)和GSE120584 (1021个AD样本和288个正常样本)两个数据集进行分析,在miRNA和mRNA中比较出正常对照组和AD组中存在差异表达的信息,筛选出差异表达miRNA和mRNA (P值均≤0.05,其中miRNA数据集FDR也≤0.05)。
2.3. DAVID做差异表达基因的本体论功能富集分析
使用DAVID对差异表达的mRNA进行GO通路富集分析,从生物学过程(BP, Biological Process)、细胞成分(CC, Cellular Component)及分子功能(MF, Molecular Function)三个角度,对这些基因的功能进行描述,以检测潜在的生物学功能和通路,筛选标准为P ≤ 0.05。
2.4. 目标基因筛选
分析生物学过程,通过注释信息,筛选与AD发病相关的信号通路基因进行后续分析。
2.5. 目标基因ceRNA调控网络分析
选取表达量高的top 10 miRNA,使用miRWalk 3.0数据库预测10个miRNA的靶向mRNA,并对预测的靶向mRNA和通过AD发病相关通路筛选到的目标差异表达mRNA取交集,利用Cytoscape 3.8.2构建miRNA-mRNA网络关系图。利用DIANA数据库对top 10 miRNA进行预测,获得lnRNA-miRNA关系对;利用ENCORI 数据库预测top 10 miRNA的靶向circRNA,获得circRNA-miRNA关系对,然后与文献中已报道的AD相关circRNA取交集,得到的重叠circRNA作为目标circRNA。最后利用以上靶向关系,构建circRNA-miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络,并探讨其与AD发病机制的关系。
3. 结果
3.1. 人类血液中差异性表达mRNA及miRNA的筛选
用GEO2R来筛选差异表达的miRNA和mRNA,得到1819个差异表达的mRNA,包括769个上调基因和1050个下调基因;742个差异表达的miRNA,包括642个上调表达miRNA和100个下调表达miRNA。
3.2. 差异表达基因的本体论功能富集分析
在DAVID软件中进行基因的本体论功能富集GO分析发现,差异表达基因中,ITGB1,SPARC,COL13A1和ITGB5等36个基因在细胞外基质(extracellular matrix organization)的生物学过程中起作用,ITGB1,RAB1A,FOXE1和WWC1等26个基因在细胞迁移(cell migration)的生物学过程中起作用,SPON1,NRP2,ITGB5和ITGB4等53个基因在细胞粘附(cell adhesion)中发挥作用。根据P值大小排序,GO分析中生物学过程富集结果前20名P值对数大小结果(见图1)。
![](//html.hanspub.org/file/1-2790085x8_hanspub.png?20211230080742929)
Figure 1. Functional enrichment of differentially expressed gene GO—BP results of biological process
图1. 差异表达基因GO功能富集——生物学过程BP结果
差异表达基因在细胞连接(cell junction)、基底膜(basement membrane)、蛋白质细胞外基质(proteinaceous extracellular matrix)等处发挥作用。根据P值大小排序,GO分析中细胞成分富集结果前20名P值对数大小结果(见图2)。
差异表达基因在肝素结合(heparin binding)、钙离子结合(calcium ion binding)、细胞外配体门控离子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)等分子功能中起作用。根据P值大小排序,GO分析中分子功能富集结果前20名P值对数大小结果(见图3)。
![](//html.hanspub.org/file/1-2790085x9_hanspub.png?20211230080742929)
Figure 2. Functional enrichment of differentially expressed gene GO—cell component CC results
图2. 差异表达基因GO功能富集——细胞组分CC结果
![](//html.hanspub.org/file/1-2790085x10_hanspub.png?20211230080742929)
Figure 3. Functional enrichment of differentially expressed gene GO—results of molecular function MF
图3. 差异表达基因GO功能富集——分子功能MF结果
3.3. 功能分析
使用DAVID对差异表达的mRNA进行GO通路富集分析,依据生物学过程,筛选了18条与神经系统疾病相关的通路(见表1),选择这些通路所对应的基因,经过对这些通路包含的基因进行重复项等的筛选,共得到252个基因。
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Table 1. 18 pathways related to AD
表1. 与AD相关的18条通路
3.4. 差异表达miRNA的靶基因预测
利用miRWalk 3.0数据库预测10个miRNA (见表2)的靶向mRNA,对预测的靶向mRNA和通路筛选到的目标差异表达mRNA取交集,得到181个重合的差异表达基因。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 2. 10 highly expressed miRNAs
表2. 10个高表达的miRNA
3.5. miRNA-Gene靶向调控网络的构建
利用miRWalk 3.0数据库预测10个高表达miRNA的靶向mRNA,并对预测的靶向mRNA和通路筛选到的目标差异表达mRNA取交集,得到相对应的miRNA-mRNA关系对,选取有特定对应关系的miRNA和mRNA (上调miRNA对应下调的mRNA,下调miRNA对应上调的mRNA),使用Cytoscape 3.8.2构建miRNA-mRNA靶向调控网络,如下(见图4),并可以借此图讨论其生物学意义。
![](//html.hanspub.org/file/1-2790085x11_hanspub.png?20211230080742929)
注:红色代表上调,绿色代表下调;方形代表miRNA,圆形代表mRNA (上调miRNA对应下调mRNA,下调miRNA对应上调mRNA)。
Figure 4. miRNA-Gene targeting regulatory network
图4. miRNA-Gene靶向调控网络
3.6. lnRNA-miRNA关系对和circRNA-miRNA关系对的预测
利用DIANA数据库获得lnRNA-miRNA关系对,选取Score = 1的lncRNA (见表3);利用ENCORI数据库中预测circRNA-miRNA关系对,然后与文献中和AD相关的circRNA取交集,得到重叠的circRNA (见表4)。
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 3. Relationship between lncRNA-miRNA-mRNA
表3. lncRNA-miRNA-mRNA关系表
![](Images/Table_Tmp.jpg)
Table 4. Relationship between circRNA-miRNA-mRNA
表4. circRNA-miRNA-mRNA关系表
4. 讨论
AD是一种进行性神经退行性疾病,是全世界老年人痴呆的主要原因。尽管在研发关于预防和治疗AD的药物方面付出了巨大努力,但目前还没有有效的成果,这在个人、医疗和社会经济层面都造成了越来越大的负担。
通过对靶mRNA的作用,miRNA参与了许多细胞过程,包括增殖、凋亡、分化、衰老、应激和免疫刺激反应,以及癌症、心血管、糖尿病、AD和其他神经退行性过程等人类疾病 [10]。本研究共选取了10个高表达的miRNA (5个上调,5个下调)。
在本研究中发现,与对照组相比,AD患者的miR-125b显著下调。此外,在APP/PS1转基因小鼠模型中也发现循环miR-125b减少 [11]。在另一项研究中,Galimberti等人使用miRNA PCR阵列分析,他们发现miR-125b显著下调 [12]。在βamyloid (Aβ)病理状态下,miR-125b表达的降低是皮质神经元神经毒性效应的关键事件。miR-125b的异常表达可能是AD脑内神经功能障碍的原因之一。
且已有文献报道hsa-miR-22与hsa-miR-24在AD病人中低表达,与本研究中的发现一致:Jovicic等 [13] 指出miR-22在阿尔茨海默症患者中低表达,增强miR-22表达可能是治疗神经退行性疾病的合理治疗策略。Hu等 [14] 通过荟萃分析发现miR-24在AD患者的脑脊液中低表达。
在差异表达基因GO功能富集—生物学过程BP分析结果中,我们选取了18条与神经系统疾病相关的通路(如表1),对预测的靶向mRNA和通路筛选到的目标差异表达mRNA取交集,得到重合的差异表达基因共181个。
通过表3可发现,Estrogen Receptor 1 (ESR1)、Intersectin 1 (ITSN1)、Myelin Basic Protein (MBP)、Phosphodiesterase 1C (PDE1C)、Ras association and pleckstrin homology domains 1 (RAPH1)等上调基因均与hsa-miR-22和hsa-miR-24有对应关系,其中Bertram等报道,ESR1 PvuII和XbaI多态性与AD风险相关,通过系统荟萃分析,ESR1基因可能是AD发病的候选基因 [15]。
在基因中值得注意的还有DiscsLarge Homolog (DLG4)。DLG4与将谷氨酸受体锚定到突触后膜有关。DLG4的异常表达可能导致谷氨酸能神经传递的紊乱。此外,DLG4参与调节淀粉样蛋白b沉积 [16]。在我们的研究中,在AD患者中检测到上调的DLG4,DLG4在化学性突触传递、信号转导和三磷酸鸟苷环水解酶(GTPase)活性的正调控等方面发挥作用,且DLG4与两个下调miRNA hsa-miR-125b-1-3p和hsa-miR-125a-3p均有对应关系,表明其在AD中的重要作用,已有文献报道上调的DLG4可能作为AD的生物标志物 [17]。
此外,已有研究发现一个可以调节特定miRNA和突触功能的circRNA-CDR1-AS在AD大脑中表达下调 [8]。还有研究发现在人脑和视网膜中一种高度表达的circRNA ciRS-7 (cerebellar degeneration-related protein 1 antisense, CDR1as),它作为一种内源性、抗补体的miRNA抑制剂或“海绵”来抑制miRNA-7的正常功能 [18]。然而,在AD发病机制中通过其他机制发挥作用的circRNA (例如,作为蛋白质翻译模板、与蛋白质相互作用形成circ Ribonucleoprotein或作为mRNA陷阱的circRNA)仍需要进一步探索。
在过去的几年里,ceRNA假说已经被大量的实验所证实。然而,ceRNA机制及其相互作用网络的研究主要在癌症研究中进行 [19] [20]。近年来,研究人员开始系统地探讨ceRNA对特定神经退行性疾病的调控机制,由于ceRNA相互作用网络是多因素的,它们可能在这些复杂的神经退行性疾病的研究中具有优势;ceRNA network的构建也有助于识别新的基因调控分子机制,从而更好地理解各种AD的发病机制,并揭示新的治疗靶点和获得有关疾病病理过程的相关信息。
我们希望基于ceRNA的分析将成为预防、延迟发病、诊断和治疗阿尔茨海默病的可行思路。然而,这项研究有一些局限性。首先,需要对更大样本的患者进行全面和详细地分析,以进一步验证我们的发现。此外,还需要后续的相关实验研究来验证我们的结果。
基金项目
2021年省级大学生创新创业训练计划项目(NO: S202110092003; NO: S202110092004);河北省教育厅青年项目(QN2019099);河北省卫生厅重点科技研究计划(20200196)。
NOTES
*通讯作者。