1. 引言
虚汗停颗粒由黄芪、大枣、浮小麦、糯稻根、牡蛎(煅)等制成,具有益气养阴,固表敛汗的功效。用于气阴不足之自汗、盗汗及小儿盗汗等症的治疗,为卫生部药品标准《中药成方制剂》收载品种。为控制虚汗停颗粒质量,苏孝共等 [1] [2] 采用HPLC法测定了虚汗停颗粒中黄芪甲苷的含量,但虚汗停颗粒由多味中药材组成,其化学成分复杂,通过单一成分的检测来控制虚汗停颗粒质量的方法略显不足。然而HPLC指纹图谱作为中药整体质量评价思路的重要体现,已被广泛应用于中药质量评价 [3] - [10]。因此,本研究采用高效液相色谱(HPLC)对虚汗停颗粒进行指纹图谱测试分析,并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)”、SPSS 22.0软件及SIMCA 14.1软件分别进行相似度评价、聚类分析和主成分分析,以期为评价虚汗停颗粒的质量提供参考依据。
2. 材料与仪器
甲醇、乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司);磷酸为分析纯(重庆川东化工有限公司);水为娃哈哈纯净水;虚汗停颗粒(广州白云山A药业有限公司),具体来源见表1。Waterse-2695高效液相色谱仪(美国Waters公司),PDA检测器;HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司);AL204-IC电子分析天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)。
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Table 1. Source and similarity of Xuhanting granules
表1. 虚汗停颗粒的来源及相似度结果
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱:DiamonsilC18 (250 × 4.6 mm, 5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)进行线性梯度洗脱,0~5 min (B:95%~95%);5~10 min (B:95%~92%);10~32 min (B:92%~70%);32~35 min (B:70%~70%);35~38 min (B:70%~40%);流速1 mL/min;检测波长260 nm;柱温30℃;进样量10 µL。
3.2. 供试品溶液的制备
虚汗停颗粒适量,研匀后,取3.0 g,精密称定,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇10 mL,超声提取30 min,放冷,定容至10 mL,摇匀,过滤,取续滤液,用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。
3.3. 方法学考察
3.3.1. 精密度实验
取同一批虚汗停颗粒样品按“3.2”项下的方法制备,在“3.1”项下的色谱条件下连续进样6次,进样量为10 µL,考察仪器的精密度。结果表明,各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%,说明仪器的精密度良好。
3.3.2. 稳定性实验
取同一批虚汗停颗粒样品按“3.2”项下的方法制备,按“3.1”项下的色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样,进样量为10 µL,考察样品的稳定性。结果表明,各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3%,说明样品在24 h稳定。
3.3.3. 重复性实验
取同一批虚汗停颗粒样品6份,按“3.2”项下的方法平行制备分析样品,按“3.1”项下的色谱条件分别进样,进样量为10 µL,考察实验方法的重复性。结果表明,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%,说明该方法的重复性良好。
3.4. 虚汗停颗粒指纹图谱的建立
按“3.2”项下制备供试品溶液,按“3.1”项下的色谱条件对12批有效期虚汗停颗粒样品及2批过期虚汗停颗粒样品进样检测分析,将所得到的色谱图数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》,得到虚汗停颗粒HPLC指纹图谱,结果见图1~5。记录虚汗停颗粒HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间及相对峰面积,结果见表2,表3。
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Figure 1. HPLC fingerprint of 14 batches of Xuhanting granules (S1~S2: expired Xuhanting granules; S3~S14: expired Xuhanting granules)
图1. 14批虚汗停颗粒HPLC指纹图谱(S1~S2:过期虚汗停颗粒;S3~S14:有效期虚汗停颗粒)
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Figure 2. HPLC chromatogram of 14 batches of Xuhanting granules
图2. 14批虚汗停颗粒HPLC对照图谱
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Figure 3. HPLC fingerprint of 12 batches of Xuhanting granules
图3. 12批有效期的虚汗停颗粒HPLC指纹图谱
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Figure 4. Control spectrum of Xuhanting granules in validity
图4. 有效期的虚汗停颗粒对照图谱
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Figure 5. HPLC fingerprint of two batches of expired Xuhanting granules
图5. 2批过期的虚汗停颗粒HPLC指纹图谱
3.5. 共有峰的确定
以保留时间约为17.939 min的峰为参照峰(有效期样品为8号峰,过期样品为13号峰),计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。12批虚汗停颗粒有效期样品有16个共有峰,2批虚汗停颗粒过期样品有22个共有峰,12批有效期样品与2批过期样品比较有15个共有峰。结果见表2和表3,见图2、图4和图6。
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Figure 6. Control spectrum of expired Xuhanting granules
图6. 过期的虚汗停颗粒对照图谱
3.6. 相似度评价
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件自动匹配14批虚汗停颗粒HPLC色谱图相关参数,以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法,测得样品与对照指纹图谱之间的相似度,不同批次虚汗停颗粒相似度在0.896~0.975,详情见表1。
3.7. 14批虚汗停颗粒的聚类分析
将有效期与过期的14批虚汗停颗粒的共有峰相对峰面积数值导入SIMCA 14.1软件中进行聚类分析,宏观的聚类结果可分为2大类,S9、S10、S11、S12、S13、S14分为第1组,S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分为第2组;而较为细微的聚类结果可分为5大类,S9、S10分为第1组,S1、S2分为第2组,S3、S4、S5、S6分为第3组,S7、S8分为第4组,S11、S12、S13、S14分为第5组。其中S1、S2为过期样品,其他为有效期样品,说明有效期与过期样品之间存在区别,同时也说明有效期样品之间也存在差异。结果如图7所示。
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Figure 7. Cluster analysis results of 14 batches of Xuhanting granules
图7. 14批虚汗停颗粒的聚类分析结果
3.8. 主成分分析( PCA)
为了综合评价有效期与过期虚汗停颗粒之间的差异性,对虚汗停颗粒进行主成分分析。以14批虚汗停颗粒共有峰的相对峰面积为变量,导入SIMCA 14.1软件,采用非监督模式识别方法进行PCA分析,得到2大特征主成分PC1,PC2,结果见图4。从方差累计贡献率来看,建立的模型累计解释能力参数R2X、预测能力参数Q2分别为0.97,0.92,说明该模型的区分程度和预测程度都良好。前2个主成分分析已基本能反映有效期与过期虚汗停颗粒的主要特征。以主成分建立坐标系,得到14批虚汗停颗粒的PCA得分图和载荷图,结果14批虚汗停颗粒被分为3组,其中样品中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8可以归为1组,样品中S11、S12、S13、S14归为2组,S9、S10可归为3组。分析结果与宏观的聚类分析结果基本相同。见图8~10。
3.9. 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)
为更好地观察组间差异,基于主成分分析结果,采用监督模式识别方法进行组间的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。从方差累计贡献率来看,建立的OPLS-DA模型累计解释能力参数R2X、预测能力参数Q2分别是0.91,0.67,说明建立的数学模型稳定且预测能力较好。OPLS-DA载荷和得分矩阵,可明显看出有效期与过期样品集中在不同区域,与主成分分析(PCA)结果一致。根据OPLS-DA模型的VIP值来进一步筛选导致差异性的主要化学成分,结果见图11。一般认为VIP > 1的变量对分类起着关键作用,结果表明VIP值大于1的主要成分分别是15号峰、13号峰、14号峰、7号峰、3号峰。提示这些成分是有效期与过期虚汗停颗粒的主要差异成分。
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Figure 8. Cumulative contribution rate of variance of the first and second principal components of 14 batches of Xuhanting granules
图8. 14批虚汗停颗粒第1,2主成分方差累计贡献率
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Figure 9. PCA score of 14 batches of Xuhanting granules
图9. 14批虚汗停颗粒PCA得分图
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Figure 10. PCA load diagram of 14 batches of Xuhanting granules
图10. 14批虚汗停颗粒PCA载荷图
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Figure 11. VIP map of 14 batches of Xuhanting granules in OPLS-DA model
图11. 14批虚汗停颗粒OPLS-DA模型差异性标志物的VIP图
4. 讨论
实验过程中考察比较了乙醇、甲醇、50%甲醇等不同提取溶剂,同时也考察了回流、超声等提取方法,结果以50%甲醇超声提取,样品色谱峰数目较多,提取较完全,且操作简单;对色谱分离过程中的波长进行考察,结果表明在260 nm检测波长下基线平稳,信息量丰富,特征峰较明显,各峰分离度较好,故选择260 nm作为本实验的检测波长;对甲醇–水、甲醇–磷酸水、乙腈–水及乙腈–磷酸水等流动相系统进行比较,发现以乙腈–0.1%磷酸水为流动相系统能够获得较好的分离效果。同时考察了流速0.5 mL/min、1 mL/min、1.5 mL/min的流速,结果发现1 mL/min的流速下分离度和分析时间较好;考察了25℃、30℃和35℃的柱温,结果发现30℃时分离度较好。
本试验建立了虚汗停颗粒的HPLC指纹图谱并作相似度及共有峰比较,结果发现不同批次的虚汗停颗粒样品相似度在0.896~0.975之间,说明有效期与过期虚汗停颗粒样品之间较为相似,但通过共有峰比较发现,12批有效期样品有16个共有峰,2批过期样品有22个共有峰,12批有效期样品与2批过期样品比较只有15个共有峰,说明有效期与过期样品的色谱峰数量有差异,且过期样品的峰数目较多,可能与过期样品因放置时间过长导致一些成分发生转化、分解及产生新成分等因素有关。将14批虚汗停颗粒计算所得的相对峰面积进行聚类分析和主成分分析,结果发现聚类分析可将有效期与过期的虚汗停颗粒识别开来,也发现有效期与过期的虚汗停颗粒主要差异共有峰。本试验通过指纹图谱相似度、共有峰的信息及结合聚类分析与主成分分析结果,能够评价虚汗停颗粒的质量,为虚汗停颗粒质量控制及临床合理应用提供参考。
基金项目
贵州省一流课程重点建设项目(黔教高发[2017] 158)。
NOTES
*通讯作者。