儿童阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患儿血清IL-35和IL-37水平的研究

Serum IL-35 and IL-37 Levels in Pediatrics with Obstructive Sleep Apnea Syndrome

摘要: 目的：探讨儿童OSAS患者血清的IL-35、IL-37的水平。方法：46例新诊断的OSAS患者和35例非呼吸暂停对照者被纳入本研究。人口学资料，既往神经肌肉病、遗传代谢病及药物史，习惯通过标准化问卷获得。所有患者均接受多导睡眠图评估。OSAS组平均年龄6.8 ± 3.3(5~9.5)岁。OSAS组中位呼吸暂停低通气指数为12.5 (6.5~21)，中位体重指数为20.5 (18~24.2)。采用ELISA法检测血清IL-35和IL-37水平。结果：OSAS患者血清IL-35和IL-37水平均明显低于健康人。随着OSAS疾病的程度加重，血清IL-35、IL-37水平进一步降低，其差异也具有统计学意义。结论：本研究提示血清IL-35和IL-37可能是OSAS的新的生物标志物，提示调节这两种细胞因子的表达可能为OSAS的治疗提供新的可能靶点。

Abstract: Objective: The aim of the present study was to investigate the serum level of IL-35. IL-37 in patients with OSAS. Methods: 46 newly diagnosed pediatrics OSAS patients and 35 non-apneic controls were enrolled in this study. Demographic data, previous history of diseases including metabolic diseases and drugs, and habits were obtained by a standardized questionnaire. All patients underwent polysomnographic evaluation. The mean age was 6.8 ± 3.3 (5~9.5) years in the OSAS group. Median apnea-hypopnea index was 12.5 (6.5~21) and median body mass index was 20.5 (18~24.2) in the OSAS group. Cytokine levels in serum were determined using ELISA. Results: The results showed that serums IL-35 and IL-37 levels were significantly decreased in OSAS patients compared with healthy subjects. The cytokine levels correlated inversely with OSAS severity. Conclusion: The study showed that serums IL-35 and IL-37 might be potentially novel biomarkers for OSAS, suggesting that regulating the expression of the two cytokines may provide a new possible target for the treatment of OSAS.

1. 引言

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(Obstructive sleep apnea syndrome, OSAS)是一种广泛的疾病，其特征是睡眠时反复出现完全或部分上气道阻塞，伴随动脉血氧饱和度下降和睡眠唤醒，导致白天过度嗜睡并引起其他白天症状 [1]。在儿童，OSAHS的病因是腺样体肥大，扁桃体肥大等方面的因素，并导致炎症和间歇性低氧所致 [2]。白细胞介素(IL-35)和IL-37是新近发现的免疫抑制细胞因子。IL-35属于IL-12家族，含有IL-12，IL-23和IL-27。它由EB病毒诱导基因3 (Ebi3)和p35 (IL-12a)两个亚基组成 [3]。在小鼠中，IL-35由Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)分泌，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中，IL-35和CD138+浆细胞诱导的调节性T细胞群 [4] 分泌。利用实验数据库挖掘和统计分析方法，Li等人报道IL-35在人体组织中不是组成型表达，但在炎症刺激下是可诱导的 [5]。IL-37又称IL-1F7，是IL-1家族的一个新成员，具有类似桶状结构的共同特征。IL-37B是五种变异体中最大的同工型，在人类多种正常组织和肿瘤中表达 [6]。最早在骨髓中发现，中性粒细胞是其合成的主要场所。主要表达于血细胞，呼吸道，胃肠道，以及皮肤角质形成细胞 [7]。在本研究中，我们旨在调查血浆IL-35和IL-37水平与OSAS严重程度之间的关系，该严重程度由呼吸暂停低通气指数(AHI)确定。

2. 资料与方法

2.1. 患者选择

我们前瞻性评估了2019年2月至2020年2月间在深圳市龙岗耳鼻喉医院睡眠医学中心就诊的患者。这项研究得到了深圳市龙岗耳鼻喉医院伦理委员会的批准，所有患者都签署书面知情同意书。46例新诊断的OSAS患儿和35例年龄匹配的非呼吸暂停对照者被纳入本研究。排除中枢性睡眠呼吸暂停、上气道阻力综合征、肺部疾病、甲状腺功能低下及糖尿病等内分泌疾病、遗传代谢病及神经肌肉病患者。记录年龄，性别，体重指数(BMI)等人口统计学资料。用Epworth嗜睡量表对每位患者进行嗜睡评定。

2.2. 多导睡眠图评估

通过计算机化系统(康迪Compumedics Grael)对所有患者进行全夜诊断性多导睡眠描记术(PSG)，记录脑电图，眼电图，颏下肌电图(EMG)，双侧胫骨前肌电图，心电图，通过电感容积描记法进行的胸壁和腹壁运动，通过鼻压传感器测量，并辅以口腔热敏电阻器，脉冲血氧计，根据美国睡眠医学学会的标准，多导睡眠描记记录在30秒内对睡眠，呼吸和氧合进行评分。儿童睡眠呼吸暂停 [8] 是一种常见的睡眠呼吸障碍性疾病，是指睡眠过程中频繁发生部分或全部上气道阻塞，口、鼻气流停止持续时间至少为2个呼吸周期以上，分为中枢性(central sleep apnea, CSA)、阻塞性(obstructive sleep apnea, OSA)和混合性三类，其中最常见的是阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)，儿童OSAHS 是指口鼻气流停止或气流减少30%以上，但存在呼吸运动，引起呼吸暂停和通气不足持续时间至少为2个呼吸周期以上，伴有打鼾、睡眠结构紊乱，低通气事件伴有血氧饱和度下降3%以上，跟据AASM标准，AHI ≥ 1即诊断为儿童OSA。根据OSAS的严重程度分为AHI = 1~5的轻度OSAS组，AHI = 5~10的中度OSAS组和AHI ≥ 10的重度OSAS组 [9]。

2.3. IL-35和IL-37测定

在进行多导睡眠描记术后的第二天早晨抽取静脉血样本，在室温下以1500 × g离心20分钟，收集血清并在−80℃保存直，直到测定结果。用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒：IL-37 (Ab 213798)，IL-35 (70-EK135-96)测定血清IL-35和IL-37。所有细胞因子测定均一式两份，并按照制造商的方案进行。

2.4. 统计分析

用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)和SPSS19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行统计评价。数据以均值±标准误差(SEM)表示。用方差分析评价血清中细胞因子表达的差异。在所有试验中，P < 0.05被认为是显著的。

3. 结果

本研究纳入了46例OSAS患者和35名对照受试者。表1列出了这两个研究组的基线特征和临床发现：OSAS患者与对照之间的年龄和性别无差异。OSAS组为6.8 ± 3.3 (5~9.5)岁，对照组为6.6 ± 3.6 (5.5~9.5)岁。81例患者中有46例(男26例，女性20例)被分类为OSAS，35例(20例男性，15例女性)作为对照组。对照组为健康受试者，无睡眠呼吸暂停。OSAS组中，AHI中位数为12.5 (6.5~21)，BMI中位数为20.5 (18~24.2)。根据AHI将患者分为轻度OSAS组(n = 10, 21.7%)，中度OSAS组(n = 20, 43.5%)和重度OSAS组(n = 16, 34.8%)。

OSAS 患者血清IL-35，IL-37水平降低。OSAS患者血清IL-35和IL-37浓度与健康对照(HC)相比，其差异具有统计学意义(表2)。轻度OSAS与中度OSAS，轻度OSAS与重度OSAS，中度OSAS与重度OSAS之间，随着OSAS疾病的程度加重，血清IL-35，IL-37水平进一步降低，其差异也具有统计学意义(P < 0.05) (表2)。

4. 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome, OSAS)是指睡眠时出现上气道咽腔水平反复的塌陷为主要特征，主要表现为睡眠时打鼾并伴有呼吸暂停，夜间反复发生低氧血症、高碳酸血

Table 1. Comparison of OSAS and control group

表1. OSAS与对照组的比较

Table 2. Serum levels of IL-35 and IL-37 in OSAS and control groups

表2. OSAS与对照组血清IL-35和IL-37水平

各组之间IL-35水平比较，P < 0.05；各组之间IL-37水平比较，P < 0.05。

症和睡眠结构紊乱，可造成多脏器损害 [1] [10]。由于呼吸暂停引起反复发作的夜间低氧和高碳酸血症，可导致高血压、冠心病、心律失常、糖尿病等，而心、脑血管的合并症最为常见和严重，甚至出现夜间猝死。目前肥胖的发生率增加，因此，OSAS的发生率也随之升高。众所周知，多导睡眠图是其标准诊断，然而它具有一定的局限性，包括成本、有限可用性及需要患者的积极配合，因此炎症因子及代谢指标在评估OSAS并发症中起到了重要的作用 [11]。早期的预测因子为临床提供依据，早发现，早治疗，积极干预，提高患者的生活质量，减少发生不良事件具有非常重要的意义。

OSAS在儿童中表现为行为异常，注意力障碍，白天过度嗜睡、多动，严重者可引起肺心病，生长发育迟缓，对儿童的身体健康、智力发育和生长带来极大影响，严重威胁儿童健康。OSAHS的病因包括腺样体肥大，扁桃体肥大、鼻中隔偏曲、小下颌、鼻甲肥大、鼻息肉等解剖方面的因素，引起炎症因子TNF-a、IL-6、IL-10、CRP过度释放等相关，主要是间歇性低氧导致 [12] [13] [14]。

到目前为止，C反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子等临床标志物已被报道与OSAS有关 [15] [16]。Mehra等人已经证明OSAS患者与对照组相比IL-6水平升高 [17]。虽然有一些有说服力的结果，但介体水平的升高被认为是OSAS患者缺氧和肥胖的继发性因素。Nural等人报道了持续气道正压(CPAP)治疗后血清CRP水平显著降低 [18]。在最近的一项研究中，作者发现在调整年龄、腰围和吸烟后，AHI和IL-6水平之间没有明显的相关性 [19]。Yokoe在Al的报告中也有类似的发现 [20]。除此之外，Vgontzas等人 [21] 发现OSAS患者的IL-6和TNF-a水平高于健康受试者。IL-37被认为具有转位到细胞核的功能，并能在细胞内外重新分布。IL-37向细胞内转移可能是血清中IL-37含量下降的原因。研究表明，血清IL-35和IL-37水平降低可能代表体内抗炎活性不足，并有望作为监测OSAS疾病严重程度的新生物标志物。在本研究中，我们首次证实OSAS患者血清IL-35和IL-37水平显著低于健康对照组，并且随着OSAS疾病的程度加重，血清IL-35，IL-37水平进一步降低，其差异也具有统计学意义。

IL-35和IL-37的作用机制目前尚不清楚。IL-35参与神经系统、消化系统、骨关节系统和呼吸系统的炎症性疾病。Zandian等人证明IL-35通过阻止自身侵袭性T细胞的发展而具有抑制脱髓鞘的作用 [22]。Kochetkova等人提示外源性IL-35可抑制CD4+T细胞，Th1和Th17细胞的活性，抑制胶原诱导性关节炎的炎症 [23]。同时，提示IL-35可以帮助呼吸系统从炎症中恢复 [24]。Wirtz等人最近证实IL-35能显著抑制Th1和Th17细胞的增殖，减少实验性结肠炎的发生，保护小肠免受免疫反应的影响 [25]。IL-35的一个亚单位Ebi3在EBV转化的B淋巴细胞和组织中广泛表达，如扁桃体和脾脏 [26]。Ebi3可负性调节IL-17，IL-22和Th17转录因子ROR T，发挥抗炎保护性免疫 [27]。IL-12亚单位p35可导致小鼠疱疹基质性角膜炎(HSK)的进展，与IL-12p40无关 [28]。IL-35的两个亚单位确实具有自身调节免疫和炎症过程的能力。当它们结合在一起形成异二聚体时，p35亚基可能起配体的作用，而另一个亚基EBI3可能主要发挥其免疫功能 [29]。到目前为止，IL-35的信号转导途径尚不清楚。同时，研究证实IL-35通过独特的受体链异源二聚体IL-12 R2和gp130或每条链的同源二聚体进行信号传递 [30]。通过IL-35受体的信号传导需要转录因子STAT1和STAT4，STAT1和STAT4形成独特的异源二聚体，结合到编码IL-12亚基p35和EBI3的基因启动子中的不同位点。IL-35可直接抑制Teff细胞增殖，将原始T细胞转化为产生IL-35的iTr35细胞，抑制Th17细胞的发育，并介导IL-10的产生。同样，IL-37是炎症、自身免疫和其他免疫学疾病的细胞因子。IL-37蛋白在类风湿性关节炎患者的滑膜细胞中高表达，但在健康人滑膜细胞中表达低水平 [31]。银屑病患者的皮损和克罗恩病皮损的巨噬细胞中IL-37的表达也显著增加 [27]。IL-37是作为前蛋白合成的，在刺激后，它被加工成成熟形式 [32]。脂多糖(LPS)与其他炎症刺激物和细胞因子一起激活caspase-1，被认为是负责IL-1家族前体成熟的主要裂解酶。IL-37具有抗菌，抗病毒，中和内毒素，抗肿瘤，免疫调节等广谱功能，对微生物具有普遍的杀灭作用。其作用机制主要是通过改变细菌细胞的通透性。它还具有提高IL-8等几种细胞因子的产生以扩大获得性免疫功能的能力 [33]。对小鼠模型的研究已经得出IL-37下调炎症的结果。TLR、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子可诱导炎性细胞因子的产生。诺德等人报道IL-37减弱上述过程，从而发挥抗炎作用 [31]。

本研究存在潜在的局限性。第一，样本量相对较小。尽管有这样的发现，显然需要进行大规模的前瞻性研究来确定OSAS及其亚组的IL-35、IL-37水平。其次，我们的研究不包含CPAP治疗后的受试者的随访记录，应进一步研究IL-35和IL-37的作用机制，以使其在今后的研究中得到应用。

5. 结论

综上所述，对OSAS患者炎症和氧化应激状态的进一步研究将有助于全面、深入地认识OSAS的发病机制。尽管各种研究证实炎症因子及代谢指标有助于OSAS的严重性的预测，但更准确、更理想的指标有待于进一步发现及临床验证应用。炎症因子和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征严重程度的相关性，提出了可能的新的检验指标，为深入探讨OSAHS的发病机制、临床评估、预后及疗效评估提供一定的参考价值。