四君子汤对于小鼠肠道菌群作用的Meta分析

Meta-Analysis of the Effects of Sijunzi Decoction on Intestinal Flora of Mice

摘要: 目的：通过Review Manager 5.3软件系统分析中药经方四君子汤对于五种小鼠肠道主要菌群作用，以确定其影响菌群种类并推测造成小鼠肠道紊乱的相关菌群。方法：通过检索各大数据库：中国知网、万方数据、维普中文网、中国生物医学文献服务系统、全国报刊、中国引文数据库，以四君子汤为变量：实验组四君子汤灌胃，对照组蒸馏水灌胃的小鼠实验，检索时间截止至2020年6月，共记提取有效纳入文献12篇，依据改良Jadad评分方法对纳入文献进行系统评价，后使用Review Manager 5.3软件对五种菌群进行Meta分析：共计实验对象1094例。Meta分析结果：1) 双歧杆菌：SMD = 2.72，95% CI [1.20, 4.23]，P = 0.0004；2) 乳酸杆菌：SMD = 2.51，95% CI [1.11, 3.91]，P = 0.0004；3) 肠杆菌：SMD = −0.47，95% CI [−1.26, 0.32]，P = 0.24；4) 肠球菌：SMD = −1.32，95% CI [−2.25, −0.38]，P = 0.006；5) 拟杆菌：SMD = −0.30，95% CI [−1.95, 1.35]，P = 0.72。结论：四君子汤有效成分对于双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌三大主要菌种有影响，明显作用于益生菌：有助于双歧杆菌和乳酸杆菌的增多，提升肠道菌群多样性，营造良好肠道环境，对调节肠道紊乱以及治愈炎症性肠病具有一定积极作用。

Abstract: Objective: Review Manager 5.3 software was used to systematically analyze the effects of Sijunzi decoction on the five kinds of major intestinal flora of mice, so as to determine the types of its in-fluence on the flora and speculate the related flora causing intestinal disorders in mice. Methods: By searching the database: CNKI, Wanfang Data, VEEP Chinese, Chinese biomedical literature service system, National Newspapers, Chinese Citation Database, taking Sijunzi decoction as the ex-perimental variable: experimental group is with Sijunzi decoction gavage, while control group mice with distilled water gavage. As of June 2020, a total of 12 literatures have been extracted for effective inclusion. The literatures are then systematically evaluated according to the improved Jadad scoring method. Finally, a number of 1094 cases of 5 bacteria were analyzed using Review Manager 5.3 software. Results: 1) Bifidobacteria: SMD = 2.72, 95% CI [1.20, 23], P = 0.0004; 2) Lactobacillus: SMD = 2.51, 95% CI [1.11, 3.91], P = 0.0004; 3) Enterobacter spp.: SMD = −0.47, 95% CI [−1.26, 0.32], P = 0.24; 4) Enterococcus: SMD = −1.32, 95% CI [−2.25, −0.38], P = 0.006; 5) Bac-teroides: SMD = −0.30, 95% CI [−1.95, 1.35], P = 0.72. Conclusion: Meta-analysis showed that the active ingredients of Sijunzi decoction have an effect on the three major strains of bifidobacteria, lactobacillus and enterococcus, and have an obvious effect on probiotics. For example it is helpful for the increase of bacteria: bifidobacteria and lactobacillus, meanwhile, improving the diversity of intestinal flora, and creating a better intestinal environment while it plays a positive role in re-gulating intestinal disorders and curing inflammatory bowel disease.

1. 引言

现代科学研究显示，人体内存在有种类丰富、数量庞大的肠道菌群，如拟杆菌属、双歧杆菌属等 [1]，而肠道菌群紊乱会引起包括糖尿病、肥胖等多种疾病的发生。近年，中医药再次引起大范围关注，中医药调节肠道菌群也得到广泛应用 [1]，其中治疗脾虚之症的经方四君子汤在现代医药广泛研究中，既承袭其传统的调节胃肠功能的作用，也赋予其保护肝脏、改善微循环、促进代谢、抗血小板聚集、抗应激反应、抗肿瘤等疗效 [2]。四君子汤由人参、白术、茯苓、甘草组成，功效健脾养胃、益气补中，是治疗脾虚证的经典代表方剂 [3]。调和、补益脾胃功效在肠道菌群调节中具有的显著作用及与益生菌等联合使用具有的良好的协同作用 [4]。本研究就探讨四君子汤对小鼠特定菌群影响，进行随机对照试验系统性评价，并综合近年相应实验数据进行Meta分析，以期为四君子汤调节小鼠肠道菌群后期更广泛实验开展提供参考、为炎症性肠病(IBD)临床治疗提供新思想、新方向。

2. 资料与方法

2.1. 资料

自中国知网(CNKI)、万方数据(Wanfang Data)、维普中文网(VEEP Chinese)、中国生物医学文献服务系统(China Biomedical Documentation Service System)全国报刊(National Newspaper)、中国引文数据库(China Citation Database)等数据库，检索主题为“四君子汤对小鼠肠道菌群影响”，关键词为“小鼠”“肠道菌群”“四君子汤”的文献，参考文献中的英文文献由Google scholar和Sci-引文索引检索补充。检索年限均从1989年到2020年。

2.2. 文献检索

2.2.1. 纳入标准

① 基于正常成年小鼠展开的研究；② 横断面研究；③ 四君子汤和小鼠肠道菌群相关性的实验；④设置实验组和对照组并且提供各组水平均值以及标准差。

2.2.2. 排除标准

① 以不健康或不合标准小鼠进行实验的研究；② 非横断面研究；③ 综述、报告类研究，或者未完整发表的研究；④ 重复发表、重复收录或者资料雷同的研究；⑤ 研究数据不完整、无法通过计算得到所需的数据的研究；⑥ 因单位不同而不能统一换算数据的研究。

2.3. 质量评估

纳入文献的方法学质量评价依据Cochrane系统评价员手册5.1.2版推荐的质量评价标准对文献质量进行评价。评价内容包括：随机分配情况、分配隐藏情况、盲法、数据完整程度、是否选择性报告结果、有无其他偏倚等方面。根据改良Jadad评分方法 [4] 对纳入文献进行质量评估：1~3分为低质量文献，4~7分为高质量文献。文献质量评估全程由两人进行，其中一人进行监督、核实，若遇分歧、一人难以判定的情况下则再次进行评定、讨论后得出结论。

2.4. 统计方法

利用Cochran协作网提供的Review Manager 5.3软件包进行Meta分析，计数资料采用相对危险度(relative risk, RR)表示，计量资料采用标准化均数差(STD mean difference, SMD)表示效应量，两者皆以95%的置信区间(Confidence Interval, CI)表示。同时对所纳入的研究进行异质性分析，若各研究间异质性检验结果P > 0.1或者I² ≤ 40%时，采用固定效应模型(FE)进行Meta分析；若各研究间异质性检验结果P ≤ 0.1或者I² > 40%则采用随机效应模型(RE)进行分析。利用Review Manager 5.3软件包合并实验组和对照组的数据均值及标准差，绘制Meta分析森林图、漏斗图，采用单因素方差分析来比较多组间资料。同时对纳入研究文献进行偏倚风险评价，获得偏倚风险百分图(Risk of bias graph)和偏倚风险总结图(Risk of bias summary)。并视纳入研究数据情况，采用敏感性分析来评价Meta分析结果的稳定性和可靠性。

3. 结果

3.1. 文献检索结果

参考纳入和排除标准，根据课题标准初步检索文献208篇，通过仔细阅读主题和简介部分进行筛选剔除不符合课题文献72篇，进一步浏览内容后摒弃雷同文献122篇，舍弃实验数据计量标准不同文献2篇后，共纳入12篇，见图1。

Figure 1. Document retrieval diagram

图1. 文献检索图

3.2. 基础纳入文献分析

依次浏览纳入文献 [5] - [16]，记录相关信息：实验对象、小鼠来源、样本量(T/C)、中药治疗组、自然恢复对照以及结果指标并做记录，并作表1如下。

Table 1. Basic inclusion of documentation information

表1. 基础纳入文献信息表

图表中信息：1、双歧杆菌指标；2、乳酸杆菌指标；3、肠杆菌指标；4、肠球菌指标；5、拟杆菌(类杆菌)指标。

3.3. 纳入文献质量分析

依次浏览纳入文献 [5] - [16]，记录相关信息：随机分配情况、分配隐藏情况、盲法使用情况、数据完整情况、是否进行选择性报告结果以及出现的其他偏倚情况，根据修改后的Jadad评分方法对研究纳入的文献进行质量评价 [4]，并作表2如下。

Table 2. Methodological quality assessment form of literature included

表2. 纳入文献方法质量学评估表

3.4. 纳入文献风险偏倚分析

根据修改后的Jadad评分方法对研究纳入的文献进行质量评价。其中1~3分视为低质量，4~7分视为高质量 [4]，本研究纳入文献均为低质量文献，见表2，且总体纳入研究数量偏少，尤其针对拟杆菌分析时只纳入了5项研究共记128例实验对象，具有严重局限性，不排除较大实验误差以及发表偏倚产生。根据偏倚风险百分图和偏倚风险总结图，见图2，不难看出，六项偏倚中，选择偏倚和随访偏倚呈现低风险；报告偏倚和其他偏倚不确定因素较多；实施偏倚、测量偏倚、报告偏倚因文献未提及相关信息故呈现高风险。经过研究小组讨论认为本次研究的偏倚情况并不对研究结果和分析结果造成严重影响，引起实验本质误差或者严重失误，且对此次偏倚结果的出现分析如下：① 相关研究均无法就小鼠实验进行盲法使用的情况阐述，故总体情况呈现盲法使用情况缺乏，无法准确判定偏倚；② 纳入研究均对实验得到的数据情况、所得结论等进行系统阐述，未提及结论、数据是否完整；③ 研究所得数据均采用统一计数方式评定各相关菌属水平，未曾隐藏个别数据，故不会对本次研究结果产生过于严重的影响。

4. Meta分析结果

为探究四君子汤对于特定菌群水平影响，本研究通过查阅已有文献数据，见表1，从双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌、拟杆菌(类杆菌)五种菌群切入分析了此汤方对于菌群水平的影响 [5] - [16]，具体Meta数据分析如下：

4.1. 双歧杆菌

为评价四君子汤对双歧杆菌的影响，纳入12项研究 [5] - [16] 共257例，实验组129例，对照组128例，见图3。根据异质性检验P < 0.00001，乳酸杆菌差异检验的I²值为94%，说明研究之间存在异质性，故采用随机效应模型分析。结果表明，实验组服用四君子汤后双歧杆菌水平高于对照组(SMD = 2.72, 95% CI [1.20, 4.23], P = 0.0004)，两组间差异有统计学意义。四君子汤灌胃实验组和蒸馏水灌胃对照组双歧杆菌水平具有明显差异，故判断四君子汤对双歧杆菌产生影响。

Figure 2. Literature risk bias

图2. 文献风险偏倚

Figure 3. Forest plot of bifidobacterium

图3. 双歧杆菌Meta分析森林图

4.2. 乳酸杆菌

为评价四君子汤对乳酸杆菌的影响，纳入12项研究 [5] - [16] 共258例，其中实验组129例，对照组129例，见图4。根据异质性检验P < 0.00001，乳酸杆菌差异检验的I²值为93%，说明研究之间存在异质性，故采用随机效应模型分析。结果表明，实验组服用四君子汤后乳酸菌水平高于对照组(SMD = 2.51, 95% CI [1.11, 3.91], P = 0.0004)，两组比较差异有统计学意义。四君子汤灌胃实验组和蒸馏水灌胃对照组乳酸杆菌水平具有明显差异，故判断四君子汤对乳酸杆菌产生影响。

Figure 4. Forest plot of lactobacillus

图4. 乳酸杆菌森林图

4.3. 肠杆菌

为评价四君子汤对肠杆菌的影响，纳入12项研究 [5] - [16] 共254例，其中实验组129例，对照组125例，见图5。根据异质性检验P < 0.00001，肠杆菌差异检验的I²值为86%，说明研究之间存在异质性，故采用随机效应模型分析。结果表明，实验组服用四君子汤后肠道细菌水平低于对照组(SMD = −0.47, 95% CI [−1.26, 0.32], P = 0.24)。两组间差异不具有统计学意义。

Figure 5. Forest plot of enterobacter

图5. 肠杆菌森林图

4.4. 肠球菌

为了评价四君子汤对肠球菌的影响，纳入10项研究 [7] - [16] 共191例，实验组为98例，对照组为93例，见图6。根据异质性检验P < 0.00001，肠球菌差异检验的I²值为85%，说明研究之间存在异质性，故采用随机效应模型分析。结果表明，实验组服用四君子汤后肠球菌水平低于对照组(SMD = −1.32, 95% CI [−2.25, −0.38], P = 0.006)，两组比较差异有统计学意义。四君子汤灌胃实验组和蒸馏水灌胃对照组肠球菌水平具有明显差异，故判断四君子汤对肠球菌产生影响。

Figure 6. Forest plot of enterococcus

图6. 肠球菌森林图

4.5. 拟杆菌(类杆菌)

为了评价四君子汤对拟杆菌门(Bacteroidetes)的影响，纳入5项研究 [5] [6] [9] [14] [16] 共128例，实验组65例，对照组63例，见图7。根据异质性检验P < 0.00001，拟杆菌门差异检验的I²值为93%，说明研究之间存在异质性，故采用随机效应模型分析。结果表明，实验组拟杆菌门水平低于对照组(SMD = −0.30, 95% CI [−1.95, 1.35], P = 0.72)，两组比较差异不具有统计学意义。

Figure 7. Forest plot of bacteroidetes

图7. 拟杆菌森林图

4.6. 发表偏倚

漏斗图对于发表偏倚的判断结果稳定性取决于纳入研究数量，当纳入文献数量较少时，其结果往往不太稳定，见图8。对于双歧杆菌的偏倚程度分析可见明显不对称且集中于漏斗图上部，提示纳入的12篇文献存在一定程度的发表偏倚。

4.7. 敏感性分析

改变文献纳入标准，对异质性为93%的双歧杆菌Meta分析数据进行敏感性分析，通过对于12项纳入文献 [5] - [16] 的逐一排查，发现唐华羽2016 [5] 实验数据对Meta分析结果影响较大，产生较大偏倚，故予以删除。删除后的Meta分析结果为：(SMD = 3.04, 95% CI [1.84, 4.23], P < 0.00001)，异质性I²较前者减少至87%，见图9。对其产生的较大异质性进行分析：不明确是否随机分组，故存在较大实验误差。

Figure 8. Funnel plot for Meta analysis of bifidobacteria

图8. 双歧杆菌Meta分析漏斗图

Figure 9. Sensitivity analysis of bifidobacteria

图9. 双歧杆菌敏感性分析

5. 讨论

据研究估计人体肠道菌群数量是人体细胞总数的10倍之多，肠道微生物是人体最复杂的微生态系统 [17] [18]，肠道菌群失调会引起心脑血管疾病、肥胖、肠易激综合症、糖尿病、炎症性肠病、营养不良、肝硬化、慢性肾病、过敏性湿疹、胃肠道癌症、艾滋病、自身免疫性疾病以及精神性疾病等 [19]，而中医基本理论与现代肠道菌群研究结果有较多契合点，适宜广泛应用于肠道菌群紊乱的治疗上。

四君子汤调节肠道菌群有效性表现在三个方面：作用机制、与中医理论契合和较西药的优越性。四君子汤多糖作用于肠道菌群可概括为肠道微生物群和草药之间的相互作用机制，归因于可吸收活性小分子和肠道微生物群及其分泌物的改变 [20] [21] [22]。同时四君子汤作为中药经方，出自宋代《太平惠民和剂局方》，为著名的补气健脾方，临床用于脾胃气虚，胃纳不佳，食少便溏 [3]。肠道菌群与中医理论中“脾”的生理功能密切相关，其互为因果 [1]。其调节肠道菌群作用更优，有效正影响肠道优势菌群，提升肠道菌群多样性 [23] - [28]，进而提升个体免疫、消化、抗病能力。且中医药调节肠道菌群较抗生素类药物有明显优势。现代抗生素的应用尤其是长期广谱抗生素的应用，会引起肠道微生态失调，进而形成并积累耐药菌 [17] [18]。通过四君子汤作用于肠道，参与人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面 [17] [19] [23] [29] [30]，对个体进行维稳调节的中医治疗方式已广泛应用于现代医学，适宜予以推广并广泛应用于临床。

本研究共纳入12篇文献，进行Meta分析，四君子汤有效成分对于双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌均具有较显著影响。四君子汤能够辅助构建微生物环境，维持肠道稳定。期待上述结果能够有更合理实验设计、大样本、多中心的随机双盲对照试验研究，对于分配隐藏、选择性报道、评分相对更高的文献进行集中分析，以期为四君子汤对小鼠肠道菌群影响研究提供更加可靠的数据基础和实验依据。

本研究尚存在的问题：① 纳入文献方法学质量偏低，用改良Jadad量表 [4] 评分显示，均为低质量文献，且多数对于分配隐藏、选择性报道以及盲法未明显提及。故根据这些方面不能排除选择性偏倚、报告偏倚；② 以双歧杆菌菌群为代表的漏斗图显示，图形不对称，集中分布与图形上方，提示存在发表偏倚。且对拟杆菌只进行了5篇文献数据分析，不排除发表偏倚的可能性。

6. 展望

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s Disease, CD)，是一种受免疫、感染、环境、遗传等多方面因素影响的慢性复发性非特异性肠道炎性疾病 [31] [32] [33] [34]，UC病变部位连续分布于结肠粘膜以及粘膜下层，CD发病位置分散于从口腔到肛门的肠胃道的各部分。IBD临床症状主要为腹痛、发烧、血便、肠梗阻、腹泻等且与发病位置相关 [31] [32] [33] [34]。据估计，截止2020年5月，IBD在英国患病人数达25万人，而美国患病人数则多达120万人，近年在发展中国家患病人数逐渐上升，更有最新数据显示，我国的IBD发病率居亚洲首位，且呈逐年上升态势 [34]。

基于四君子汤对于肠道菌群的特殊作用，联想到其具有缓解炎症性肠病(IBD)的可能性。目前，国内外治疗IBD的主要药物为糖皮质激素、氨基水杨酸、益生菌和免疫抑制剂等，但服用后多发生不良反应，且多数患者长期服用后可能导致肠胃疾病加重 [33]。多个研究证明，IBD病症的发生发展和肠道菌群具有一定联系：IBD患者肠道菌群多样性下降，病症发生发展时引起肠道菌群稳态失衡 [35] [36] [37] [38]。根据已有研究显示的肠道菌群自身作用机制和免疫屏障的维稳调节作用，联系本研究结果：四君子汤可能具有调节肠道菌群、增加肠道菌群多样性的功效，故推测四君子汤对IBD的诱导和缓解可能发挥一定作用，以期为临床治疗IBD提供新的、待为考究的思路和方向。

基金项目

成都中医药大学杏林学者学科人才科研提升计划(ZRQN2020001)；四川省青年科技创新团队项目(19CXTD0055)。

参考文献

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。